蓖麻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)對(duì)重金屬Cu2+的脅迫響應(yīng)※

●梁嘯天 羅 蕊 趙志強(qiáng) 包春光 賈崇寧 霍玉淼 任文靜 袁樸芳 高 昶 黃鳳蘭,4,5,6,7,8※※

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院 內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院 內(nèi)蒙古 通遼028000；3.通遼市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心 內(nèi)蒙古 通遼 028000；4.蓖麻育種國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)蒙古 通遼 028000；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心 內(nèi)蒙古 通遼 028000；6.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)蒙古 通遼 028000；7.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 內(nèi)蒙古 通遼 028000；8.蓖麻產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心 內(nèi)蒙古 通遼 028000）

蓖麻（Ricinus communisL.）是世界上重要的非食用油料植物，含油率高達(dá)60%左右，被譽(yù)為“可再生的石油資源”[1]，因其具有特色經(jīng)濟(jì)價(jià)值而廣受重視[2]。據(jù)報(bào)道，土壤被重金屬污染后，蓖麻仍可正常生長(zhǎng)，表明蓖麻是一種對(duì)重金屬抗性較強(qiáng)的植物，具有修復(fù)重金屬污染土地的功能。有學(xué)者對(duì)銅礦區(qū)周圍生長(zhǎng)的野生蓖麻進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)蓖麻不僅能夠在銅礦區(qū)正常生長(zhǎng)，還能夠在植株內(nèi)部富集Cu2+，表現(xiàn)出較強(qiáng)的重金屬抗性[3]。

近年來，土壤重金屬污染現(xiàn)象日益嚴(yán)重，主要重金屬污染物包括汞、鎘、鉛、銅、鉻、砷、鎳等[4]，對(duì)土壤危害較大，其無法被土壤中的微生物分解，導(dǎo)致更多的重金屬離子在土壤中累積而轉(zhuǎn)化為危害更大的化合物。部分重金屬會(huì)通過食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重危害人類身體健康。研究發(fā)現(xiàn)，通過植物的吸收、根濾、穩(wěn)定可以降低土壤重金屬污染程度，具有一定的土壤修復(fù)作用[5]。銅是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量元素，參與植物體內(nèi)多種氧化酶的組成及氧化還原反應(yīng)，適量的銅能夠?qū)χ参锷L(zhǎng)起到促進(jìn)作用，過量的銅則會(huì)導(dǎo)致植物葉片枯黃進(jìn)而抑制其光合作用，甚至阻礙植物對(duì)其他元素的吸收[6]。

目前，眾多學(xué)者研究了水稻和小麥對(duì)Cu2+脅迫的耐受性，也有關(guān)于蓖麻對(duì)鎘脅迫以及鉛、鋅復(fù)合脅迫的耐受性研究，但未見關(guān)于蓖麻對(duì)Cu2+脅迫的耐受性研究[7-9]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇不同濃度CuSO4溶液對(duì)蓖麻進(jìn)行處理，研究蓖麻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)對(duì)重金屬Cu2+的脅迫響應(yīng)，以期驗(yàn)證蓖麻作為特色經(jīng)濟(jì)植物在應(yīng)對(duì)重金屬污染土壤修復(fù)問題的應(yīng)用可行性以及適用條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料本實(shí)驗(yàn)所用的植物材料為2129 品系蓖麻種子，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 試劑材料液氮、 愈創(chuàng)木酚、30%H2O2、五水硫酸銅（CuSO4·5H2O）、20%三氯乙酸（TCA）、0.5%硫代巴比妥酸（TBA）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.8，50mM）、還原性輔酶II（NADPH）、谷胱甘肽（GSSG）。

1.1.3 其他材料蛭石、土。

1.2 儀器設(shè)備

萬用電爐（DL-1），電子天平（Satirius BSA224S-CW），高速大容量低溫離心機(jī)（Thermo MULTIFUGE X3R），小型高速低溫離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5424 R），HVE-50 型高溫高壓滅菌鍋（日本），-80℃超低溫冷凍冰箱（Thermo Scientific Forma 702），酶標(biāo)儀（Iinfinite M200 pro），電腦（Lenovo）。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用飽滿度一致的蓖麻種子1 200 粒，共設(shè)置12 組培養(yǎng)方案，對(duì)照組使用清水，另外11 組處理組分別使用Cu2+濃度為120mg/L、240mg/L、360mg/L、480mg/L、600mg/L、720mg/L、840mg/L、960mg/L、1 080mg/L、1 200mg/L、1 320mg/L的CuSO4溶液，放在25 ℃有光照的溫室中培養(yǎng)72h[10]。

當(dāng)蓖麻生長(zhǎng)到四葉期時(shí)，選取植株高度、葉片大小一致的20 盆幼苗分別設(shè)置為10 個(gè)對(duì)照組和10 個(gè)處理組。對(duì)照組幼苗生長(zhǎng)期間每次澆1 L 清水，處理組幼苗生長(zhǎng)期間每次澆Cu2+濃度為840mg/L（當(dāng)Cu2+濃 度 為840mg/L 時(shí)， 蓖 麻既不受嚴(yán)重抑制也不受促進(jìn)生長(zhǎng)，視其為臨界值）的CuSO4溶液1L。分別在7d、15d、21d 拍攝植株整體、葉及根的照片，對(duì)比處理組與對(duì)照組的區(qū)別[11]。

1.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.4.1 測(cè)定指標(biāo)不同處理組環(huán)境下測(cè)定蓖麻種子萌發(fā)率、根形態(tài)（根長(zhǎng)、根粗）、種子生理指標(biāo)[MDA（丙二醛）含量、POD（過氧化物酶）活性、CAT（過氧化氫酶）活性、GR（谷胱甘肽還原酶）活性]、幼苗生理指標(biāo)(同種子生理指標(biāo))。

1.4.2 測(cè)定方法

1.4.2.1 種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)不同處理組的種子萌發(fā)個(gè)數(shù)與未萌發(fā)個(gè)數(shù)，計(jì)算種子萌發(fā)率，公式：

1.4.2.2 根形態(tài)使用游標(biāo)卡尺測(cè)量不同處理已萌發(fā)蓖麻種子的15 個(gè)根長(zhǎng)數(shù)據(jù)與5 個(gè)根粗?jǐn)?shù)據(jù)并記錄[13]。

1.4.2.3 蓖麻萌發(fā)種子生理指標(biāo)通過對(duì)蓖麻種子萌發(fā)率的計(jì)算以及萌發(fā)種子根長(zhǎng)根粗的測(cè)量，確定2129 品系蓖麻種子對(duì)重金屬Cu2+濃度的最大抗性值，按以下方法測(cè)定最大抗性濃度萌發(fā)種子的MDA 含量、POD 活性、CAT 活性、GR 活性。蓖麻萌發(fā)種子預(yù)處理。將不同處理下的萌發(fā)種子置于預(yù)冷的研缽中，倒入液氮研磨成干粉，以每份0.4g 分裝于15mL 離心管內(nèi)，加入4mL 的PBS，用搖床搖10min，混成勻漿后在6℃、6 000 rpm下離心10min，留取上清液即獲得酶粗提液。將上清液每份1mL 分裝于1.5mL 離心管內(nèi)，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

MDA 的測(cè)定方法。吸取1mL 上清液置于玻璃試管中并加入2mL 0.5% TBA 沸水浴15min，然后進(jìn)行冰上冷卻，冷卻后吸取1mL 置于1.5mL 離心管內(nèi)，10 000rpm 下離心10min。取200μL 上清液測(cè)定OD450、OD532、OD600。對(duì)照組以PBS 代替酶液調(diào)零。

MDA 濃度和含量的計(jì)算公式：

其中，V1為提取液總體積（4mL）；V2為測(cè)定用酶液體積（1mL）；W 為樣品鮮重（0.4g）[15]。

POD 的測(cè)定。取50mL PBS 置于燒杯中，加入28μL 愈創(chuàng)木酚攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，再加入19μL 30%的H2O2，混勻后置于水浴鍋中34℃加熱10min。避光保存于4℃冰箱中備用。取2mL 混合液并加入20μL 酶液，測(cè)定OD470值3min 內(nèi)的變化。對(duì)照組以PBS 代替酶液調(diào)零。以每分鐘OD 值變化（升高）1 為1 個(gè)酶活性單位（U）。按下式計(jì)算活性：

其中，ΔOD470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重（0.4g）；t為反應(yīng)時(shí)間（3min）；V1為提取酶液總體積（4mL）；V2為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（0.02mL）[16]。

CAT 的測(cè)定。4mL 離心管中各加入1.5mL 的PBS、1mL 蒸餾水，置于水浴鍋中25℃預(yù)熱5min，向每個(gè)離心管中加入0.3mL H2O2（0.1mol/L），混勻后備用。每管再加入200μL 酶液，測(cè)定OD240值3min 內(nèi)的變化。對(duì)照組以PBS 代替酶液調(diào)零。以每分鐘OD值變化（減小）0.1 為1 個(gè)酶活性單位（U）。按下式計(jì)算活性：

其中，ΔOD240為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重（0.4g）；t為反應(yīng)時(shí)間（3min）；V1為提取酶液總體積（4mL）；V2為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（0.2mL）[17]。

GR 的測(cè)定。4mL 離心管中各加入1 550μL 的PBS、140μL 的NADPH，260μL 的GSSG，混 勻后備用。每個(gè)離心管中加入300μL 酶液，測(cè)定OD340值2min 內(nèi)的變化。對(duì)照組以PBS 代替酶液調(diào)零。

在一定溫度下，每克樣本每分鐘催化1μmol NADPH 氧化為1 個(gè)酶活單位（U）。按下式計(jì)算活性：其中，ΔOD340為處理組反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；ΔOD對(duì)照為對(duì)照組反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；ε為NADPH 摩爾消光系數(shù)6.22×103L·mol/cm；d為比色皿內(nèi)徑（5.85mm）；W為樣品鮮重（0.4g）；t為反應(yīng)時(shí)間（2min）；V1為提取酶液總體積（4mL）；V3為反應(yīng)體系總體積（2.25mL）；V2為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（0.3mL）[18]。

1.4.2.4 蓖麻幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定測(cè)定處理組與對(duì)照組蓖麻幼苗的MDA 含量、POD 活性、CAT活性、GR 活性四項(xiàng)生理指標(biāo)。測(cè)定方法同種子生理指標(biāo)測(cè)定方法[15-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻種子萌發(fā)對(duì)重金屬Cu2+的脅迫響應(yīng)

2.1.1 蓖麻種子萌發(fā)率使用濃度為0mg/L、120mg/L、240mg/L、360mg/L、480mg/L、600mg/L、720mg/L、840mg/L、960mg/L、1 080mg/L、1 200mg/L、1 320 mg/L 的CuSO4溶液分別處理蓖麻種子。蓖麻種子萌發(fā)率比較結(jié)果，見表1。

表1 種子萌發(fā)率比較結(jié)果

由表1 可知，雖然組間顯著性差異明顯，但Cu2+濃度的高低對(duì)2129 品系蓖麻種子的萌發(fā)率無明顯影響規(guī)律。

2.1.2 蓖麻萌發(fā)種子根的形態(tài)學(xué)圖1 為使用清水組與Cu2+濃度為840mg/L 的CuSO4溶液處理后的蓖麻種子萌發(fā)狀況，圖2 為萌發(fā)種子根長(zhǎng)測(cè)量結(jié)果，圖3 為萌發(fā)種子根粗測(cè)量結(jié)果。

由圖1、圖2 可知，蓖麻種子的根長(zhǎng)對(duì)Cu2+低濃度與高濃度存在不同的脅迫響應(yīng)。Cu2+濃度低時(shí)，可以促進(jìn)蓖麻種子根的生長(zhǎng)；Cu2+濃度高時(shí)，可以抑制蓖麻種子根的生長(zhǎng)。由圖1、圖3可以看出，蓖麻種子根粗的生長(zhǎng)受Cu2+的脅迫效應(yīng)不明顯。

2.1.3 蓖麻萌發(fā)種子的生理指標(biāo)使用濃度為0mg/L、840mg/L 的CuSO4溶液分別處理蓖麻種子后，處理組與對(duì)照組各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果，見圖4。

由圖4 可以看出，用Cu2+濃度為840mg/L 處理的蓖麻種子萌發(fā)后，處理組MDA 含量和CAT活性明顯高于對(duì)照組，但POD 活性和GR 活性明顯低于對(duì)照組。

2.2 蓖麻幼苗生長(zhǎng)對(duì)重金屬Cu2+的脅迫響應(yīng)

2.2.1 蓖麻幼苗形態(tài)學(xué)統(tǒng)計(jì)清水對(duì)照組與Cu2+濃度為840mg/L 處理組各10 盆（每盆1 株），當(dāng)蓖麻幼苗長(zhǎng)到四葉期的時(shí)候分別使用Cu2+濃度為840mg/L 的CuSO4 溶液及清水對(duì)兩組幼苗進(jìn)行澆灌。圖5、圖6、圖7 分別為處理7d、15d、21d后的蓖麻幼苗生長(zhǎng)狀況。其中，A 為植株對(duì)比照片，左為處理，右為對(duì)照（CK）；B 為葉片對(duì)比照片，左為處理，右為對(duì)照（CK）；C 為根部對(duì)比照片，左為處理，右為對(duì)照（CK）。

由圖5、圖6、圖7 可以看出，隨著處理時(shí)間的增加，處理組蓖麻植株高度逐漸矮于對(duì)照組，處理組根量明顯少于對(duì)照組，處理組葉脈褪綠逐漸加深。

2.2.2 蓖麻幼苗四葉期葉片生理指標(biāo)清水對(duì)照組與Cu2+濃度為840mg/L 處理組各10 盆（每盆1株），當(dāng)蓖麻幼苗長(zhǎng)到四葉期的時(shí)候，使用濃度為840mg/L 的CuSO 溶液及清水對(duì)兩組幼苗進(jìn)行澆灌。圖8 為蓖麻葉片的生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果。

由圖8 可知，當(dāng)使用Cu2+濃度為840mg/L的 CuSO4溶液澆灌蓖麻21d 后，隨著處理時(shí)間的增加，對(duì)照組MDA 含量同處理組相比，對(duì)照組MDA 含量在7d 至15d 升高，在15d 至21d 下降；處理組MDA 含量在7d 至15d 升高，在15d至21d 降低，但變化趨勢(shì)不如對(duì)照組明顯。對(duì)照組POD 活性同處理組相比，其變化趨勢(shì)大致相同，對(duì)照組與處理組P OD 活性在7d 至15d內(nèi)大幅度降低，在15d 至21d 略微升高，但處理組POD 活性升高趨勢(shì)較對(duì)照組明顯。對(duì)照組CAT 活性同處理組相比，對(duì)照組CAT 活性在7d 至15d 內(nèi)明顯降低，在15d 至21d 明 顯升高；處理組CAT 活性在7d 至15d 內(nèi)明顯升高，在15d 至21d 略微降低。對(duì)照組GR 活性同處理組相比，其變化趨勢(shì)有明顯不同，對(duì)照組GR 活性在7d 至15d 明顯降低，在15d 至21d 明 顯升高；處理組GR 活性在7d 至15d 內(nèi)明顯升高，在15d 至21d 明顯降低。蓖麻種子在Cu2+濃度為1 320mg/L 時(shí)仍未死亡，表明蓖麻種子對(duì)Cu2+具有很強(qiáng)的耐受性；蓖麻幼苗在Cu2+濃度為840mg/L 時(shí)處理至21d 仍未死亡，證明蓖麻幼苗對(duì)Cu2+也有很強(qiáng)的耐受性。

3 結(jié)果與分析

3.1 重金屬Cu2+對(duì)蓖麻種子萌發(fā)的影響

蓖麻種子萌發(fā)的過程需要大量的物質(zhì)與能量，儲(chǔ)存在種子中的有機(jī)物在種子萌發(fā)時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)化成容易被胚吸收的形態(tài)，從而為種子萌發(fā)提供能量[19]，在其萌發(fā)階段，受外界因素影響較大，當(dāng)使用重金屬Cu2+對(duì)其進(jìn)行脅迫時(shí)，蓖麻種子的萌發(fā)受到影響，Cu2+通過抑制蓖麻種子內(nèi)酶的活性，從而抑制蓖麻種子內(nèi)有機(jī)物的轉(zhuǎn)化，使蓖麻種子萌發(fā)受到抑制。此次種子萌發(fā)率實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)時(shí)未考慮到三次重復(fù)，因此在經(jīng)過Cu2+濃度為840mg/L的CuSO4溶液處理蓖麻種子后，雖然在組間表現(xiàn)出差異性顯著卻未能表現(xiàn)出重金屬Cu2+對(duì)蓖麻種子萌發(fā)率的影響規(guī)律，但在測(cè)量其根長(zhǎng)時(shí)卻發(fā)現(xiàn)不同Cu2+濃度處理組萌發(fā)種子的根長(zhǎng)與對(duì)照組相比有明顯不同，根據(jù)蓖麻萌發(fā)的形態(tài)學(xué)特征和生理指標(biāo)變化可以判斷重金屬Cu2+的脅迫可能有：抑制種子內(nèi)酶的合成，從而抑制種子內(nèi)有機(jī)物的轉(zhuǎn)化。POD 活性、GR 活性顯著性減少，可能是重金屬Cu2+抑制種子細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性，進(jìn)而抑制了種子萌發(fā)后根的生長(zhǎng)。通過查閱文獻(xiàn)可知，水稻在Cu2+濃度為6.4mg/L 進(jìn)行種子萌發(fā)處理時(shí)會(huì)出現(xiàn)種子死亡現(xiàn)象，小麥在Cu2+濃度為32mg/L 進(jìn)行種子萌發(fā)處理時(shí)會(huì)出現(xiàn)種子死亡現(xiàn)象[20]。通過蓖麻與水稻種子、小麥種子對(duì)比，可以看出蓖麻對(duì)Cu2+脅迫具有很強(qiáng)的耐受性。

3.2 重金屬Cu2+對(duì)蓖麻幼苗生長(zhǎng)的影響

蓖麻生長(zhǎng)過程中會(huì)通過葉片進(jìn)行光合作用，而根系吸收養(yǎng)分為蓖麻生長(zhǎng)提供必需能量，因此，蓖麻產(chǎn)量會(huì)受其幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)影響[21]。根據(jù)蓖麻幼苗的形態(tài)學(xué)特征和生理指標(biāo)變化可以判斷Cu2+的脅迫可能有：重金屬Cu2+污染土壤后，蓖麻根部開始吸附Cu2+并在體內(nèi)運(yùn)輸，從而導(dǎo)致植株代謝過程紊亂，葉片內(nèi)葉綠素減少或失去活性，葉脈失綠，光合作用受到影響[22]，其根系吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力也會(huì)有所下降，造成幼苗生長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良。蓖麻幼苗期是受重金屬Cu2+脅迫的最顯著時(shí)期[23]，處理組CAT 活性和GR 活性與對(duì)照組相比顯著性增加，表明蓖麻的抗逆性增強(qiáng)。Cu2+對(duì)蓖麻幼苗生長(zhǎng)的脅迫原理可能與脅迫種子的原理相同，通過抑制植株過氧化物酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽還原酶的合成，從而抑制植株有機(jī)物的轉(zhuǎn)化[24]。因本次盆栽實(shí)驗(yàn)中重金屬Cu2+濃度雖達(dá)到840mg/L 卻未出現(xiàn)植株死亡現(xiàn)象，故認(rèn)為2129 品系蓖麻是有重金屬抗性并具有一定重金屬積累作用的特色經(jīng)濟(jì)作物[25]。通過查閱文獻(xiàn)可知，水稻幼苗對(duì)Cu2+耐受最大濃度為10mg/L，Cu2+濃度越高，對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的抑制作用越大[26]；小麥幼苗對(duì)Cu2+耐受最大濃度為100mg/L，Cu2+濃度越高，對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的抑制作用越大[27]。通過蓖麻與水稻、小麥幼苗相比，可以看出蓖麻對(duì)Cu2+脅迫具有很強(qiáng)的耐受性。

4 結(jié)論

蓖麻種子和幼苗對(duì)Cu2+的脅迫響應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：種子萌發(fā)階段，萌發(fā)率在組間雖表現(xiàn)出明顯差異但未表現(xiàn)出明顯脅迫規(guī)律；根長(zhǎng)隨Cu2+濃度的增加整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；根粗隨濃度的增加無顯著變化，但使用Cu2+濃度為840mg/L 的CuSO4溶液對(duì)蓖麻種子進(jìn)行萌發(fā)處理時(shí)，蓖麻種子對(duì)Cu2+表現(xiàn)出最大抗性；Cu2+濃度為840mg/L時(shí)，蓖麻萌發(fā)根長(zhǎng)度最接近平均值，對(duì)其進(jìn)行四項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)處理組種子MDA 含量和CAT 活性明顯高于對(duì)照組，但POD 活性和GR 活性明顯低于對(duì)照組。幼苗生長(zhǎng)階段，用Cu2+濃度為840mg/L 的CuSO4溶液處理后，隨處理時(shí)間的增加，處理組植株高度逐漸矮于對(duì)照組；處理組葉片與對(duì)照組相比葉脈明顯褪綠；處理組根量明顯少于對(duì)照組；生理指標(biāo)方面，處理組和對(duì)照組MDA 含量、POD 活性的變化趨勢(shì)相同，CAT 活性、GR 活性變化趨勢(shì)相反，MDA 含量、CAT 活性以及GR 活性升至最大值，POD 活性降至最小值。由此可得出結(jié)論，蓖麻主要發(fā)揮其超累積優(yōu)勢(shì)，對(duì)重金屬實(shí)現(xiàn)強(qiáng)有效的解毒及累積，所以蓖麻完全可以為修復(fù)重金屬污染及環(huán)境治理發(fā)揮特殊優(yōu)勢(shì)。