紅芪多糖對骨髓間充質干細胞和成骨細胞的影響

趙良功，方瑤瑤，劉小花，封士蘭*

紅芪多糖對骨髓間充質干細胞和成骨細胞的影響

趙良功1, 2，方瑤瑤3，劉小花3，封士蘭3*

1. 甘肅省骨關節疾病研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000 2. 蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730000 3. 蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000

研究3種新型紅芪多糖（HPS-1、HPS-2、HPS-3）對大鼠骨髓間充質干細胞rBMSCs和顱骨成骨細胞ROBs成骨性分化的影響。采用MTT法檢測rBMSCs細胞和ROBs細胞增殖；采用堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒檢測rBMSCs細胞和ROBs細胞的ALP活性；采用茜素紅染法檢測rBMSCs和ROBs細胞礦化結節的形成情況。HPS-1（20、50 μg/mL）作用48 h顯著促進rBMSCs細胞增殖（＜0.05、0.01），HPS-1（20 μg/mL）作用48 h顯著促進ROBs細胞增殖（＜0.01）；HPS-2和HPS-3對2種細胞的增殖無促進作用。HPS-1（50、100 μg/mL）顯著升高rBMSCs細胞的ALP活性（＜0.01），HPS-1（10、20、50 μg/mL）顯著升高ROBs細胞的ALP活性（＜0.05、0.01）；HPS-3（50 μg/mL）顯著升高rBMSCs細胞的ALP活性（＜0.05），HPS-2對2種細胞ALP活性沒有促進作用。HPS-1顯著增加rBMSCs和ROBs細胞中鈣化結節面積和數量（＜0.01），HPS-2和HPS-3對rBMSCs和ROBs細胞鈣化結節的形成沒有促進作用。HPS-1可增強rBMSCs和ROBs細胞ALP活性和成骨相關因子表達，并顯著促進rBMSCs和ROBs細胞分化、礦化。

紅芪多糖；成骨分化；骨髓間充質干細胞；顱骨成骨細胞；堿性磷酸酶

紅芪是豆科植物多序巖黃芪Hand. -Mazz. 的干燥根，為甘肅省的道地藥材。紅芪的主要成分包括多糖類、黃酮類、皂苷類、多種氨基酸類等，其中紅芪多糖（hedysarum polysaccharides，HPS）是紅芪的主要藥效成分，具有提高免疫力、抗衰老、抗肝纖維化、抗氧化等藥理作用[1]。課題組前期研究發現經傳統水提法分離純化的紅芪多糖HPS3d可促進成骨細胞增殖分化，具有防治骨質疏松的潛質[2]。傳統的水提法提取率低、溶解度差、后期純化困難，課題組采用復合酶聯合超聲提取工藝顯著提高了紅芪粗多糖的得率和含量[3]；紅芪粗多糖采用DEAE-52柱色譜分離純化，用蒸餾水及0.1、0.3 mol/L氯化鈉溶液依次洗脫，得到3種免疫活性較好的均質性多糖組分（HPS-1、HPS-2、HPS-3）[4]。氣相色譜分析表明，3種新型多糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖5種單糖組成，HPS3d不含甘露糖；3種新型多糖蛋白質含量均低于HPS3d；HPS-1多糖含量高于HPS3d且相對分子質量遠小于HPS3d[2,4]。本研究探討3種新型紅芪多糖（HPS-1、HPS-2、HPS-3）對大鼠骨髓間充質干細胞rBMSCs和顱骨成骨細胞ROBs增殖、分化和礦化的影響，為紅芪多糖的后續研究開發奠定基礎。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠，1月齡，體質量120～170 g；SPF級出生48 h以內的SD大鼠乳鼠，體質量25～30 g，均由蘭州大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（甘）2013-0002。動物分籠飼養，3只/籠，在（22±2）℃、12 h光/暗周期、相對濕度（50±5）%下，自由飲食飲水，適應性飼養1周。所有程序和實驗規程均經蘭州大學動物保護與使用倫理委員會批準，批準號SCXK（GaN）2018-0002，并按照國際標準和動物福利道德準則進行。

1.2 藥品與試劑

胎牛血清購自Clark公司；II型膠原酶購自Biosharp公司；青霉素、鏈霉素、DMEM培養基、DMEM/F12培養基，購自Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶、檸檬酸、地塞米松（質量分數為98%）、抗壞血酸、檸檬酸鈉、β-甘油磷酸鈉均購自索萊寶公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（批號20180614）購自南京建成生物工程研究所；木瓜蛋白酶、纖維素酶，購自上海麥克林生化科技有限公司；95%乙醇、醋酸乙酯均為分析純。

1.3 儀器

BS224S/BP211D電子分析天平（德國Sartorius公司）；XK96-6調速平板振蕩器（姜堰市新康醫療器械有限公司）；KQ-3200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CKX53倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；CO-150型CO2細胞培養箱（美國LabServ公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；Vaioskan Flash多功能酶標儀（美國賽默飛世爾公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 紅芪多糖的制備

采用復合酶聯合超聲提取法制備得到紅芪粗多糖[3,5]。將紅芪粗多糖加適量蒸餾水溶解后，經DEAE-52柱分離純化，用蒸餾水及0.1、0.3 mol/L氯化鈉溶液依次洗脫，得到3個多糖組分，分別為HPS-1、HPS-2、HPS-3，多糖質量分數分別為96.44%、98.02%、95.20%。

2.2 rBMSCs細胞和ROBs細胞的分離培養

2.2.1 貼壁分離法體外培養rBMSCs細胞 SD大鼠脫頸椎處死，75%酒精浸泡消毒10 min，無菌剝離股骨和脛骨，剪去兩端骨骺，將DMEM/F12培養基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、1000 U/mL鏈霉素）注入骨髓腔并反復沖洗，收集細胞懸液，過200目細胞篩得到單細胞懸液。調整細胞密度為1×107/mL，接種于25 cm2培養瓶中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，次日更換培養基，之后每2天用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，并更換培養基。當細胞融合度達到80%以上時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代用于后續實驗。

2.2.2 酶消解法體外分離培養ROBs細胞 新生SD大鼠乳鼠，75%酒精浸泡消毒10 min，無菌取顱骨，剔除血管和結締組織，無菌PBS沖洗2次，將顱骨剪碎至約1 mm3。碎骨片裝入無菌培養瓶中，加入胰蛋白酶（0.5 mg/mL）于37 ℃振蕩消化2次，10 min/次，棄去消化液；加入II型膠原酶（1 mg/mL）于37 ℃振蕩消化6次，15 min次。收集最后4次消化液，過200目細胞篩除去骨碎片，將單細胞懸液調整至細胞密度為3×104/mL，接種于25 cm2培養瓶中。于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，次日更換培養基，之后每2天用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次。當細胞融合度達到80%以上時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代用于后續實驗[6]。

2.3 藥物的配制

分別精密稱取HPS-1、HPS-2、HPS-3，溶解于培養基中，分別制成質量濃度為1、5、10、20、50、100、200 μg/mL的溶液。

2.4 紅芪多糖對rBMSCs細胞和ROBs細胞增殖的影響

分別取處于對數生長期的rBMSCs細胞和ROBs細胞，以1×104/孔接種于96孔板，細胞貼壁后，分別加入100 μL HPS-1（5、10、20、50、100、200 μg/mL）、HPS-2（5、10、20、50、100、200 μg/mL）、HPS-3（5、10、20、50、100、200 μg/mL），對照組加入不含藥物的培養基，培養24 h或48 h，避光加入10 μL MTT，孵育4 h，棄去培養基，加入100 μL DMSO，振蕩溶解結晶，用酶標儀測定490 nm處吸光度值。

2.5 紅芪多糖對rBMSCs細胞和ROBs細胞ALP活性的影響

分別取第1代rBMSCs細胞和ROBs細胞，以1×104/孔密度接種于12孔板，細胞生長接近融合時，更換成骨誘導培養基（含1×10?8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸），分別加入100 μL HPS-1（5、10、20、50、100、200 μg/mL）、HPS-2（5、10、20、50、100、200 μg/mL）、HPS-3（5、10、20、50、100、200 μg/mL），對照組加入不含藥物的培養基，每3天更換1次誘導培養基，連續培養8 d后，按照ALP試劑盒說明書檢測ALP活性[7]。

2.6 紅芪多糖對rBMSCs細胞和ROBs細胞鈣化結節的影響

分別取第1代rBMSCs細胞和ROBs細胞，以1×104/孔密度接種于12孔板，待細胞生長接近融合時，更換成骨誘導培養基，rBMSCs細胞分別加入100 μL HPS-1（50 μg/mL）、HPS-2（50 μg/mL）、HPS-3（50 μg/mL），ROBs細胞分別加入100 μL HPS-1（20 μg/mL）、HPS-2（20 μg/mL）、HPS-3（20 μg/mL），對照組加入不含藥物的培養基，每3天更換1次培養液，連續培養12 d，采用選擇性結合鈣的茜素紅染色法檢測鈣化結節的形成情況，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件統計鈣化結節染色陽性區域的面積和數量。

2.7 統計學分析

3 結果

3.1 3種紅芪多糖對rBMSCs細胞和ROBs細胞增殖的影響

如表1所示，與對照組比較，20、50 μg/mL HPS-1顯著促進rBMSCs和ROBs細胞增殖（＜0.05、0.01）；HPS-2和HPS-3對rBMSCs和ROBs細胞增殖沒有促進作用，且200 μg/mL HPS-2顯著抑制rBMSCs細胞增殖（＜0.05、0.01），200 μg/mL HPS-3顯著抑制rBMSCs和ROBs細胞增殖（＜0.05、0.01）。

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

*< 0.05**< 0.01control group, same as below tables

3.2 3種紅芪多糖對rBMSCs細胞和ROBs細胞ALP活性的影響

ALP活性的提高是骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的重要標志。如表2所示，與對照組比較，50、100 μg/mL HPS-1顯著升高rBMSCs細胞中ALP活性（＜0.01），10、20、50 μg/mL HPS-1顯著升高ROBs細胞中ALP活性（＜0.05、0.01）；200 μg/mL HPS-2顯著降低rBMSCs細胞中ALP活性（＜0.01）；50 μg/mL HPS-3顯著升高rBMSCs細胞中ALP活性（＜0.05），50 μg/mL HPS-3顯著升高rBMSCs細胞中ALP活性（＜0.05），200 μg/mL HPS-3顯著降低rBMSCs細胞和ROBs細胞中ALP活性（＜0.05、0.01），100 μg/mL HPS-3顯著降低ROBs細胞中ALP活性（＜0.01）。

3.3 3種紅芪多糖對rBMSCs細胞和ROBs細胞鈣化結節形成的影響

鈣化結節的形成是成骨細胞成熟的標志之一。如圖1所示，與對照組比較，HPS-1（50 μg/mL）顯著增加rBMSCs細胞中鈣化結節的數量和面積（＜0.01），HPS-2（50 μg/mL）顯著減少rBMSCs細胞中鈣化結節的數量（＜0.01），HPS-3對rBMSCs細胞鈣化結節的形成沒有影響。如圖2所示，與對照組比較，HPS-1顯著增加ROBs細胞中鈣化結節的數量（＜0.01），HPS-2和HPS-3對ROBs細胞鈣化結節的形成沒有影響。

4 討論

骨質疏松癥是一種常見的系統性骨骼疾病，以骨密度降低和骨微觀結構退化為特征，可導致骨骼無力、骨強度下降、骨脆性增加。國際骨質疏松基金會預計，2020—2050年，中國患有骨質疏松癥的人數為2.87億，骨量減少的人數可能高達5.33億[8]。骨質疏松癥的發病機制為多種因素促進骨組織的吸收，同時抑制骨組織的形成，骨重建平衡遭到破壞，破骨細胞骨吸收大于成骨細胞骨形成作用，因此增強成骨細胞活性或誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞方向分化對骨質疏松的防治具有重要意義[9-10]。

本研究探討了3種紅芪多糖（HPS-1、HPS-2、HPS-3）對rBMSCs細胞和ROBs細胞增殖、分化和礦化的影響，發現3種紅芪多糖（5、10、20、50 μg/mL）均不會對rBMSCs和ROBs細胞產生毒性，20、50 μg/mL HPS-1可促進細胞增殖。ALP和鈣化結節可分別作為成骨分化早期和晚期的標志，本研究表明HPS-1能明顯促進2種細胞ALP活性和礦化結節的形成，HPS-2和HPS-3對2種細胞成骨分化沒有顯著促進作用，甚至產生負性作用；50 μg/mL HPS-1對rBMSCs細胞的促進作用較大，20 μg/mL HPS-1對ROBs細胞的促進作用較大。課題組前期研究結果發現，3種紅芪多糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖5種單糖組成，但HPS-1主要由葡萄糖組成（87.41%），HPS-2和HPS-3主要由阿拉伯糖和半乳糖組成；HPS-2相對分子質量最大，為1.420×105，HPS-3次之，HPS-1最小，為9.336×103；HPS-1的糖苷鍵為α構型，HPS-2和HPS-3主要為β構型[3]。因此，推測3種紅芪多糖對rBMSCs和ROBs細胞成骨分化活性的差異可能與其單糖基組成、相對分子質量、結構和構象有關。綜上，HPS-1具有一定的成骨活性，具有潛在的增強骨骼強度的能力，為骨質疏松的治療提供了新的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 師志強, 張雪梅, 薛志遠, 等. 紅芪多糖3的熒光標記及其組織分布研究[J]. 西北藥學雜志, 2018, 33(5): 611-615.

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[3] 楊秀艷, 薛志遠, 楊亞飛, 等. 紅芪多糖的復合酶聯合超聲提取工藝、理化特性及抗氧化活性的研究[J]. 中國中藥雜志, 2018, 43(11): 2261-2268.

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Effects of hedysarum polysaccharides on osteogenic differentiation of rBMSCs and ROBs

ZHAO Liang-gong1, 2, FANG Yao-yao3, LIU Xiao-hua3, FENG Shi-lan3

1. Gansu Provincial Key Laboratory of Bone and Joint Diseases, Lanzhou 730000, China 2. Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730000, China 3. School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

To investigate the effects of hedysarum polysaccharides (HPS-1, HPS-2, HPS-3) on promoting osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells (rBMSCs) and rat calvarial osteoblasts (ROBs).MTT assay was used to detect the proliferation of rBMSCs and ROBs. Alkaline phosphatase (ALP) activity of rBMSCs and ROBs were detected by ALP kit. Mineralized nodule formation of rBMSCs and ROBs was detected by alizarin red S staining.HPS-1 (20, 50 μg/mL) significantly promoted the proliferation of rBMSCs (< 0.05, 0.01), HPS-1 (20 μg/mL) significantly promoted the proliferation of ROBs (< 0.01), HPS-2 and HPS-3 had no influence on promoting the proliferation of rBMSCs and ROBs. HPS-1 (50, 100 μg/mL) significantly increased ALP activity in rBMSCs (<0.01), HPS-1 (10, 20, 50 μg/mL) significantly increased ALP activity in ROBs (<0.05, 0.01), HPS-3 (50 μg/mL) significantly increased ALP activity in rBMSCs (<0.05). HPS-2 had no influence on increasing ALP activity in rBMSCs and ROBs. HPS-1 significantly increased the area and number of calcified nodules of rBMSCs and ROBs (<0.01), HPS-2 and HPS-3 had no influence on promoting the formation of calcified nodules of rBMSCs and ROBs.HPS-1 could enhance the cell activity and osteogenesis-related factor expression, and significantly promote the differentiation and mineralization of rBMSCs and ROBs cells.

hedysarum polysaccharides; osteogenic differentiation; bone marrow stromal cells; calvarial osteoblasts; alkaline phosphatase

R285.5

A

0253 - 2670(2021)02 - 0432 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.016

2020-07-10

國家自然科學基金資助項目（81703664）

趙良功（1986—），男，博士，主治醫師，從事骨關節退行性疾病的治療。E-mail: Lzxtj2008@hotmail.com

封士蘭（1957—），博士，教授，從事中草藥及中藥制劑中化學成分分離分析研究。E-mail: fengshl@lzu.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]