水稻遺傳轉化研究進展

彭小群，王夢龍

（惠州學院生命科學學院，廣東惠州516007）

0 引言

水稻是世界上的主要糧食作物之一，約一半的人口以其為主食。隨著人口的不斷增長和生活質量的逐步提高，人們對水稻的產量和品質提出了更高的要求。因此，如何提高水稻的產量和品質是當今農業生產面臨的重大問題之一。傳統的水稻育種方法是通過利用物種間的雜交優勢來提高水稻的產量與品質，但有限的種質資源以及較長周期的聚合育種大大限制了水稻育種的快速發展。基因工程技術的出現，解決了物種之間的隔閡問題。目前可通過轉入外源基因或基因編輯的方法來改變水稻的相關性狀，從而獲得人們所需要的各種水稻品種，而這些技術方法的實現都離不開水稻的遺傳轉化。所謂水稻的遺傳轉化，是指把分離到的目的基因導入到水稻體內，并使目的基因在水稻體內穩定表達和遺傳。隨著水稻基因組測序的完成，水稻已成為了一種重要的單子葉模式植物，供眾多研究者所使用。遺傳轉化作為一種重要的研究手段，目前已被廣泛應用于水稻研究的各個方面，包括基因功能研究、T-DNA插入突變體庫構建和農藝性狀改良等。本綜述主要對水稻的遺傳轉化方法及特點，農桿菌介導的水稻遺傳轉化研究進展和影響因素等方面做簡要綜述。

1 常見水稻遺傳轉化方法

隨著基因工程技術的不斷發展，20世紀80年代末到90年代初，人們便開始利用PEG法、電激法、脂質體法、基因槍法和花粉管通道法等方法進行水稻遺傳轉化，這些方法屬于基因導入直接轉化法[1-2]。直到20世紀90年代中期，農桿菌介導法才開始應用于水稻的遺傳轉化，并逐步得到廣泛應用[1-2]。

1.1 PEG法

PEG法是一種建立和應用較早的細胞融合方法，其原理是通過利用聚乙二醇等作為介質在pH較高的條件下誘導外源DNA進入原生質體。PEG能促使外源DNA與細胞膜之間發生黏連，通過改變膜表面電荷使細胞膜的通透性發生改變，然后經原生質體的內吸作用使外源DNA進入原生質體，并隨機整合到染色體上，最后經原生質體再生形成完整的植株。利用該方法，目前已經在多種禾谷類作物中獲得了轉基因植株[3]。如Zhang等[4]通過PEG法成功獲得了含有GUS基因的轉基因植株。1992年，丁群星等[5]對PEG法進行研究時發現PEG濃度、PEG的處理時間和質粒DNA的轉化濃度等都會對轉化效率有著不同程度的影響。PEG法對原生質體細胞的傷害較少，可有效避免嵌合體的產生，同時也不受受體細胞的限制，可轉化較大片段的基因等。不足之處是該方法耗時較長，對基因型的依賴較強；并且該方法以原生質體為轉化受體，容易產生白化苗，轉化效率較低，因此人們尚未普遍應用PEG法進行水稻的遺傳轉化[1,6]。

1.2 電激法

電激法又稱之為電穿孔法，與PEG法相同的是它也是以原生質體為受體，其原理是通過高壓脈沖使細胞膜形成瞬間通道，從而可使外源DNA穿過。該方法最先開始應用于動物細胞，隨后在單、雙子葉植物和真菌中都得到應用[7]。劉明華等[8]通過電激法成功將玉米轉座因子Ac/Ds導入水稻花藥懸浮細胞并再生成植株。肖成江等[9]的研究表明電激法的轉化效率受到電激條件、蔗糖濃度和質粒DNA濃度的影響。電激法適合瞬時表達，具有操作簡單和轉化率高等特點，但使用的儀器價格較為昂貴，并且在電穿孔時易損傷原生質體，會導致其再生率降低等[10]。通過將PEG法與電激法相結合，可大大提高轉化效率[2]。隨著電激法的不斷發展，現可通過電激法直接在植物組織或細胞上打孔，從而將外源基因成功導入植物細胞[1]。

1.3 脂質體法

脂質體法是指通過利用脂類物質所合成的雙層膜囊結構將基因包裹成球狀，然后導入到原生質體或細胞中，從而成功實現遺傳轉化。根據操作不同可分為兩種類型：一種是脂質體融合法，即通過將脂質體與原生質體進行共培養，使它們之間發生膜融合，經原生質體的吞噬作用可使脂質體內攜帶的外源基因轉入原生質體，最后經原生質體的再生培養而產生新的植株；另一種是脂質體注射法，即通過顯微注射方法把含有外源基因序列的脂質體注射到目標細胞內，即可成功進行轉化[2]。脂質體轉化法具有較高的DNA包裝能力、低免疫原性，并可進行大規模生產[11]；此外，該方法操作簡單、對細胞毒性小[12]。朱禎等[13]用脂質體法將α-干擾素基因成功轉入水稻原生質體中，并獲得了轉化植株。Matthews等[14]用脂質體法成功將大腸桿菌RNA和DNA導入胡蘿卜原生質體，并證明脂質體介導的大分子轉入原生質體的效率與脂質體本身成分有關。由于脂質體法的轉化效率較低，約只有電激法的五分之一，因此脂質體介導的遺傳轉化未得到普遍應用。有研究證明，在脂質體法轉化過程中加入一定量的PEG可有效提高轉化效率[15]。

1.4 基因槍法

基因槍法的原理是通過將外源基因包被在金粒或鎢粒表面，在高壓條件下可將微粒高速射入細胞，外源基因即可隨機整合到植物基因組中。基因槍法由美國康奈爾大學Sanford于1987年最早提出，而Klein最早將基因槍法進行應用[16]。基因槍可分為火藥式基因槍、壓縮氣體型基因槍和高壓放電型基因槍3種類型[17]。基因槍的靶受體十分廣泛，包括懸浮細胞、原生質體、葉圓盤、根或莖的切段、愈傷組織、種子胚分生組織和幼胚等[18]。Oard[19]通過基因槍轉化法成功獲得了轉基因水稻愈傷組織，并檢測到GUS基因的表達。盧萍等[16]研究表明基因槍轟擊參數、微彈射程和受體的生理因素等都可影響基因槍法的轉化效率。基因槍法具有受體范圍廣泛、操作簡單、可控性高等優點，并且利用基因槍法可同時轉化多個基因[7]。不足之處是基因槍轟擊具有隨機性，導致外源基因的整合位點極不固定，產生的轉基因后代容易突變，因此不利于外源基因的穩定表達[20]；此外，基因槍價格非常昂貴，并且轉化費用高，導致其沒得到廣泛的使用。

1.5 花粉管通道法

花粉管通道法是指通過植物受精時形成的花粉管通道將外源基因導入受精卵，并最終整合到受體基因組。花粉管通道法遺傳轉化可在2個不同階段進行，一個階段是在花粉尚未受精之前，將外源基因進行花粉轉化，從而整合到精核基因組中，最后通過受精得到轉化植株；另一個階段是在植物完成受精后，在受精卵細胞尚未形成完整細胞壁和核膜系統前，可將外源基因通過花粉管通道進入受精卵，轉化無完整細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞，然后通過生物自身的種質系統或細胞結構功能來實現外源基因的成功轉化[17]。花粉管通道法是通過利用自然生殖過程，可有效避開植株再生問題。花粉管通道法最早是在矮牽牛中得到應用，如1980年Hess[21]利用花粉管通道法獲得了花色變異子代矮牽牛。Zhou等[22]利用花粉管通道法成功將DNA導入到棉花花粉管中，獲得了抗枯萎病的品種。王才林等[23]通過花粉管通道法，成功將抗除草劑Bar基因轉入水稻品系‘E32’中。已有研究表明，外源DNA的分子結構、DNA片段的大小和導入液的濃度等都對花粉管通道法的轉化效率產生影響[24]。花粉管通道法具有操作簡單，花費的時間和金錢較少；但也存在諸多缺點，如技術還相對不完善，缺乏對相關轉化機制的系統性研究，操作具有一定的隨機性和盲目性，并且轉化效率較低等[25]。

1.6 農桿菌介導法

現今應用最多的是農桿菌介導法。農桿菌介導法是天然狀態下存在的轉化系統。農桿菌(Agrobacterium)廣泛存在于土壤中，屬于革蘭氏陰性菌。目前水稻遺傳轉化常用的農桿菌有根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenis)兩種，其中根癌農桿菌中含有Ti(Tumer induce)質粒，發根農桿菌中含有Ri(Root induce)質粒。Ti質粒和Ri質粒都含有一段T-DNA(TDNA region)，即轉移DNA(Transfer DNA)，也被叫做T區。在感染植物時，根癌農桿菌或發根農桿菌能將Ti質粒或Ri質粒中的T-DNA區通過植物傷口進入細胞，并最終整合到基因組中[17]。T-DNA轉入植物是植物與農桿菌相互作用的結果，而Vir區基因群在其中起非常重要的作用[1]。農桿菌介導法轉化時發生的基因轉移是一種自然行為。農桿菌介導法最早應用于雙子葉植物的轉化，隨著轉化載體和轉化方法的改進，農桿菌介導法也在單子葉植物中逐漸得到推廣應用[1]。早在1986年，Baba等[26]用PEG法將農桿菌與原生質體融合，獲得了能夠合成胭脂堿的水稻愈傷組織。這個實驗的成功嘗試，拉開了農桿菌介導水稻轉化的序幕。農桿菌介導法具有費用低、易操作、基因沉默少、穩定性好、拷貝數低和便于遺傳分析等諸多優點，因此受到全世界水稻育種家的青睞，被廣泛應用[7]。農桿菌介導法取得的巨大成功主要得益于最佳受體材料的選擇、促進Vir基因的活化、減少農桿菌對受體的傷害、菌種和質粒組合的選擇等幾個方面[1]。

2 農桿菌介導法在水稻中的研究

農桿菌介導的水稻遺傳轉化研究開始于20世紀90年代中期，并得到不斷改進發展[2]。1993年，Chan等[27]用農桿菌介導法對粳稻幼胚進行遺傳轉化，成功獲得了轉基因植株。1994年，Hiei等[28]通過對農桿菌介導的轉化方法進行改進，使轉化效率達到了28.6%，農桿菌介導的水稻轉化取得突破性進展。Rashid等[29]利用農桿菌介導法成功轉化秈稻水稻，為農桿菌介導法在秈稻上的使用奠定了基礎。林擁軍等[30-31]以對農桿菌介導的水稻轉化進行研究，成功建立了粳稻和秈稻高效率的農桿菌轉化體系。Toki等[32]通過以誘導生長5天的水稻成熟胚愈傷組織進行農桿菌轉化，成功獲得了轉基因植株，該方法不僅避免了體細胞在繼代過程中可能產生的突變，而且大大縮短了轉化周期，從而可快速獲取轉基因植株。蘇益等[33]對粳稻誘導8天的早期愈傷進行轉化，同樣也快速獲得了轉基因水稻植株。Lin等[34]采用穿刺法對粳稻進行農桿菌轉化，該方法無需進行愈傷的誘導，因此進一步縮短了轉化周期。Saika和Toki的研究發現秈稻栽培品種‘Kasalath’的愈傷組織轉化效率是粳稻‘日本晴’的10倍[35]。Ozawa和Takaiwa的研究表明用懸浮培養的‘日本晴’愈傷組織進行轉化，效率可提高5～ 10倍[36]。Shri等[37]在對秈稻轉化進行研究時，發現通過改變培養條件和在共培養基中加入L-半胱氨酸可將轉化效率由12.82%提高到33.33%。高璐和薛永來通過2,4-D誘導水稻成熟種子，發現誘導7天的愈傷組織與農桿菌共轉化時效率最高，而抗性愈傷的篩選時間以2～ 4周為最佳[38]。

3 農桿菌介導的水稻遺傳轉化影響因素

農桿菌介導的水稻轉化技術在當今世界發展已經較為成熟。隨著農桿菌介導法的不斷應用，人們將注意力逐漸轉向如何提高效率上。研究表明，農桿菌介導的水稻遺傳轉化效果與農桿菌的侵染能力、水稻細胞轉化應答能力和轉化因子再生能力有關[2]。已知影響農桿菌介導的水稻遺傳轉化效率有兩方面：一是農桿菌的侵染體系；二是水稻的再生體系和組織培養。

3.1 侵染體系對農桿菌介導的遺傳轉化影響

在農桿菌的侵染體系中，菌種與載體的正確選擇會極大影響轉化效率。不同的菌種具有不同的宿主范圍，所以同一宿主選擇不同的菌種進行侵染，其轉化效率也會有所不同[2]。如用EHA105、LBA4404和AGL1三種農桿菌侵染愈傷組織時，它們對愈傷組織的轉化能力存在一定差異，其中EHA105的侵染轉化能力最好。另外，侵染時選擇的菌濃度和侵染時間不同也會對轉化造成一定的影響[39]。

3.2 再生體系和組織培養對農桿菌介導的遺傳轉化影響

在水稻的再生體系中，不同的品種，其可培養性也存在巨大差異。雖然粳稻、秈稻和瓜哇稻都已建立起農桿菌介導的轉化體系，但它們的轉化效率差異較大。通常粳稻容易轉化，而秈稻轉化較難，因此選擇正確合適的受體是實現基因成功轉化的先決條件；并且同一受體采用不同的外植體，其對轉化的效率也有重大影響，如水稻幼胚的轉化效率高于成熟胚[2]。

再生系統還需要有合適的培養基與之相對應，否則同樣難以實現成功轉化。在組織培養過程中，通常會通過在培養基中加入一定量的激素來促進細胞分裂、誘導愈傷和生根等，并且不同的品種其所需激素的最適濃度也不一樣。例如在愈傷組織形成方面，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是必須成分。不同的水稻品種其誘導愈傷組織形成的最適2,4-D濃度不同。如張燕紅等[40]以新疆主栽品種‘秋田小町’為研究材料時，發現當2,4-D濃度為2 mg/L時，其綜合誘導效果最好，愈傷組織的誘導率可達93.87%；而尹梅等[41]以水稻‘滇優粳3號’和‘滇優粳5號’為實驗對象時，發現4 mg/L的2,4-D才是誘導愈傷較合適的激素濃度。值得一提的是，前人的研究表明2 mg/L的2,4-D才是誘導滇優粳稻愈傷組織的最佳濃度[42]，這說明水稻在經過長期的培養后，其愈傷組織對不同濃度物質的敏感度有所改變。

3.3 其他因素對農桿菌介導的遺傳轉化影響

在對農桿菌介導的遺傳轉化進行研究中，一些研究者還在愈傷組織的分化效率方面開展了相關研究。如鄭杰[43]在提高抗性愈傷組織的分化效率實驗中，從已去殼種子的消毒時間、愈傷組織繼代培養時間和農桿菌侵染濃度3個方面入手，通過對前人的實驗條件加以改進，發現種子消毒30 min、繼代培養6～ 7天的愈傷組織和農桿菌侵染濃度OD600值為0.145～ 0.190時，種子的誘導率和愈傷組織的轉化率都處于一個較高的水平。周蕾和陳晨[44]的實驗同樣也證實了該結果。此外，周蕾和陳晨[44]對影響農桿菌介導的水稻遺傳轉化各因素進行研究時發現光照誘導愈傷比暗培養誘導縮短了約一周的時間，且誘導率也有所提高。

4 展望

水稻是中國的主要糧食作物，也是進行植物研究最重要的模式植物之一。建立高效快速穩定的水稻遺傳轉化體系，是開展水稻基因功能研究和進行水稻性狀改良等科學研究的基礎。經過近30年的發展，水稻遺傳轉化技術在世界范圍內得到廣泛應用。以PEG法、脂質體法、電激法、基因槍法、花粉管通道法和農桿菌介導法等方法為代表的水稻遺傳轉化方法都得到較大發展，其中尤以農桿菌介導法發展最為迅猛，并得到廣泛應用。目前在水稻中應用最多的是農桿菌介導法。相比于其他方法，農桿菌介導法具備更多的優點，因此備受研究者青睞。近年來雖然水稻農桿菌介導法的研究取得較大發展，但仍存在諸多問題，如秈稻材料轉化效率較低，轉化容易產生農桿菌污染，轉化時間還相對較長等。綜合以上，未來水稻農桿菌介導法研究應重點解決以下幾個方面的問題：（1）選擇合適的秈稻受體轉化材料進行轉化和合適的農桿菌菌株進行愈傷組織侵染；（2）適當降低農桿菌侵染濃度和侵染時間、減少農桿菌與愈傷組織的共培養時間；（3）選擇易于快速誘導愈傷的外植體、連續的光照和合適的光強與溫度進行培養。