高效液相色譜-串聯質譜法測定葡萄酒中4種有機磷類除草劑殘留量

郭愛靜,花中霞,張 弘,張世勇,辛 佳,王 可

(石家莊市疾病預防控制中心,石家莊市化學毒物檢測及風險預警技術創新中心,石家莊 050011)

有機磷類除草劑是分子結構中含有磷元素的一類除草劑,主要包括莎稗磷、甲基胺草磷、抑草磷和哌草磷等。有機磷類除草劑因高效、成本低而廣泛應用在農業生產中。此類農藥具有中等或高毒性,在人體中會抑制乙酰膽堿酯酶活性,造成神經系統損傷而引發中毒[1-2]。鑒于其危害性,我國在國家標準GB 2763-2019《食品中農藥最大殘留限量》中規定了莎稗磷在稻谷、糙米中的最大殘留量為0.1 mg·kg-1[3]。

有機磷農藥的主要檢測方法有氣相色譜法(GC)[4-7]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[8-11]、氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)[12-15]、液相色譜法(LC)[16-17]和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[18-20]。目前,國內外對莎稗磷或抑草磷的檢測雖有報道[21-25],但對于有機磷類除草劑在食品中殘留檢測的文獻相對較少。目前,葡萄酒中農殘的檢測以殺蟲劑和殺菌劑為主,對除草劑殘留的檢測相對較少,尚未發現利用高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)檢測葡萄酒基質中有機磷類除草劑的報道。

本工作采用乙酸乙酯作為提取劑,分散固相萃取法凈化,建立了葡萄酒中莎稗磷、甲基胺草磷、抑草磷和哌草磷等4 種有機磷類除草劑的HPLCMS/MS分析方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200-6410B型液相色譜-串聯質譜儀,配電噴霧離子源;Mettler Toledo AE240型電子天平;IKA MS3 型渦旋振蕩器;Elma T-460/H 型超聲清洗器;TG16-WS 型臺式高速離心機;Organomation EVAP-12型氮吹儀;Millipore Milli-Q 型超純水機。

3種有機磷類除草劑標準儲備溶液:1.00 g·L-1,稱取抑草磷、哌草磷和甲基胺草磷標準品各10.0 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL 棕色容量瓶中,此溶液保存于-20 ℃冰箱中。

莎稗磷標準溶液:10 mg·L-1。

4種有機磷類除草劑混合標準溶液:移取適量的1.00 g·L-1的3種有機磷類除草劑標準儲備溶液和10 mg·L-1的莎稗磷標準溶液,混合后用甲醇稀釋并定容至1.00 mg·L-1。

甲基胺草磷(Lot:SZBD350XV),純度不小于99.8%;莎稗磷(Lot:407101O)、抑草磷(Lot:41016),純度不小于98.0%;哌草磷(Lot:30416),純度不小于99.0%;乙腈、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸均為色譜純;N-丙基乙二胺(PSA)、無水硫酸鎂(MgSO4)、氯化鈉(NaCl)均為分析純;試驗用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Agilent ZORBAX XDB-C18色譜柱(50 mm×4.6 mm,1.8μm);柱溫30 ℃;進樣量3μL;流量0.3 mL·min-1;流動相A 為0.1%(體積分數,下同)甲酸溶液,B 為甲醇;等度洗脫,A 相與B相體積比為15∶85;運行時間5 min。

2)質譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子模式;多反應監測(MRM)模式;干燥氣溫度350 ℃;干燥氣流量10 L·min-1;霧化氣壓力206.8 k Pa;毛細管電壓4 000 V;碰撞氣為高純氮氣(純度大于99.999%);各離子對駐留時間均為100 ms。其他質譜參數見表1,表中“?”為定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

稱取2.000 0 g葡萄酒樣品,置于50 mL 離心管中,加入1.00 g NaCl和12 mL的乙酸乙酯,渦旋30 s,超聲10 min,以4 000 r·min-1轉速離心5 min,取出10 mL有機相轉移至盛有1.00 g PSA、0.20 g 無水MgSO4的離心管中,渦旋30 s,離心5 min,取上清液6 mL,在40 ℃下氮吹至近干,用1.0 mL 85%(體積分數,下同)甲醇溶液復溶后,渦旋30 s,經0.2μm 濾膜過濾,按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

在優化的儀器工作條件下對100.0μg·L-1的4種有機磷類除草劑混合標準溶液進行測定,其色譜圖見圖1。

2.2 提取條件的選擇

2.2.1 提取劑

試驗考察了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷及不同體積比的乙腈-乙酸乙酯混合溶液等提取體系用于葡萄酒樣品中4種有機磷類除草劑的提取時對回收率的影響。在葡萄酒基質中添加25μg·kg-1的4種有機磷類除草劑混合標準溶液,按照1.3節試驗方法進行測定,不同提取劑所得回收率見圖2。

圖1 4種有機磷類除草劑的總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of 4 organophosphorus herbicides

由圖2可知:用乙酸乙酯提取時,4種有機磷類除草劑的回收率為78.7%～84.1%,回收率最高,這可能是4種物質在乙酸乙酯中均有較好的溶解度的原因。因此,試驗選擇乙酸乙酯作提取劑。

2.2.2 超聲提取時間

超聲可以加速提取劑在樣品中提取目標組分的過程。試驗考察了超聲提取時間分別為5,10,15,20 min時對4種有機磷類除草劑回收率的影響,結果見圖3。

圖2 提取劑對4種有機磷類除草劑回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on the recovery of 4 organophosphorus herbicides

圖3 超聲提取時間對4種有機磷類除草劑回收率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the recovery of 4 organophosphorus herbicides

由圖3可知:回收率隨著超聲提取時間的延長先升高后降低;超聲提取時間為10 min時,4種有機磷類除草劑的回收率最好;繼續延長超聲提取時間,回收率反而下降,可能是由于超聲提取時間過長目標物發生降解所造成的。因此,試驗選擇超聲提取時間為10 min。

2.3 凈化劑用量的選擇

試驗考察了凈化劑PSA 和無水MgSO4用量的不同對4種有機磷類除草劑回收率的影響。固定無水MgSO4用量0.20 g,分別對PSA 用量為0.20,0.40,0.75,1.00,1.20 g時4種有機磷類除草劑的回收率進行考察。結果發現:隨著PSA 用量的增加回收率先升高后降低;PSA 用量為1.00 g時,回收率最好,為81.5%～96.7%。這可能是由于PSA 能有效吸附葡萄酒基質中的有機酸、糖類和色素等雜質,故隨著PSA 用量增加回收率提高,但PSA 過量也會吸附待測組分,反而回收率降低。

固定PSA 用量為1.00 g,分別對無水MgSO4用量為0.10,0.20,0.40,0.75,1.00 g時4種有機磷類除草劑的回收率進行比較。結果表明:無水MgSO4用量為0.20 g時,回收率最好,為83.4%～95.8%。這是因為水在乙酸乙酯中溶解度很低,加入一定量的無水MgSO4會除去乙酸乙酯層的水分,但無水MgSO4過量會吸附待測組分,反而導致回收率降低。因此,試驗最終選擇用1.00 g PSA、0.20 g無水MgSO4對樣品進行凈化。

2.4 流動相的選擇

使用100.0μg·L-14種有機磷類除草劑混合標準溶液進樣,分別考察了乙腈-0.1%甲酸和甲醇-0.1%甲酸體系為流動相時對4種有機磷類除草劑峰形和響應值的影響。結果表明:當流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液體系時,甲基胺草磷響應值較低;當流動相為甲醇-0.1%甲酸溶液體系時,整體響應值都有明顯地提高,因此,選擇甲醇-0.1%甲酸溶液體系作為試驗的色譜流動相。試驗進一步優化了兩相比例,發現體積比為85∶15的甲醇和0.1%甲酸溶液作流動相、流量為0.3 mL·min-1時,4種有機磷類除草劑的色譜峰峰形和分離度均較好。試驗采用體積比為85∶15 的甲醇和0.1%甲酸溶液等度洗脫。

2.5 質譜條件的選擇

4種有機磷類除草劑的分子結構中均含有N、O等原子,均易結合H＋,極性較強。因此,選擇電噴霧電源子正離子模式(ESI＋)進行檢測。以100.0μg·L-14種有機磷類除草劑混合標準溶液進樣,進行一級全掃描篩選母離子,發現各除草劑的[M＋H]＋峰均響應較強,確定為母離子;通過選擇離子監測(SIM)優化碎裂電壓,使其母離子響應達到最佳;用產物離子掃描確定兩個響應強、干擾小的子離子,同時優化碰撞能量,使其子離子獲得最佳響應。每個除草劑的兩個子離子中響應較高的為定量離子,最終確定質譜條件,具體參數見表1。

2.6 基質效應

分別用85%甲醇溶液和葡萄酒基質空白提取溶液配制兩組質量濃度均為10.0,20.0,50.0,100.0μg·L-1的混合標準溶液系列,按照儀器工作條件進行測定。比較同一質量濃度下在甲醇和基質溶液中同一被測組分的峰面積,計算基質效應(ME)。ME＝B/A×100%(B為空白樣品基質中添加某一質量濃度待測物按照儀器條件測定的響應值,A為純溶劑中添加同一質量濃度待測物相同儀器條件下測定的響應值[26]。ME 值為80.0%～120.0%時,表明基質效應較小;ME 值低于80.0%或高于120.0%時,表明有較強的基質抑制或增強作用[27]。試驗結果表明:哌草磷的 ME 值在96.4%～104.8%之間,沒有明顯的基質效應;其他3種有機磷類除草劑的ME 值為53.6%～73.5%,有較強地基質抑制作用。因此,試驗采用基質匹配標準曲線(工作曲線),以減少基質效應的影響。

2.7 工作曲線與檢出限

在葡萄酒基質空白樣品溶液中添加4種有機磷類除草劑標準溶液,配制成濃度均為1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0μg·L-1的混合標準溶液系列,按儀器工作條件進行測定。以各化合物的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制工作曲線。

分別以3倍信噪比和10倍信噪比計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)。4種化合物的線性范圍、線性回歸方程、相關系數、檢出限和測定下限見表2。

表2 線性參數、檢出限及測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

由表2可知:4種有機磷類除草劑的質量濃度均在1.0～200.0μg·L-1內與對應的峰面積呈線性關系,相關系數在0.999 0以上。4種有機磷類除草劑的檢出限為0.01～0.04μg·kg-1,測定下限為0.03～0.13μg·kg-1。

2.8 精密度和回收試驗

稱取空白試樣2.000 0 g,在5,20,50μg·kg-1等3個濃度水平下進行加標回收試驗,按試驗方法進行測定,每個加標水平平行測定5次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3。

表3 精密度和回收試驗結果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

由表3可知:4種有機磷類除草劑的回收率為69.3%～99.2%,相對標準偏差(RSD)為2.3%～8.1%,表明該方法的準確度高、精密度較好。

2.9 樣品分析

按試驗方法對10份葡萄酒樣品進行測定,其中4份檢出抑草磷,質量分數為0.53～0.76μg·kg-1。雖然目前我國還沒有其限量標準,但結果表明葡萄酒中存在抑草磷的殘留污染。相關部門應加強監管,對其危害進行評估,加快制定葡萄酒中抑草磷的限量標準。

本工作建立了同時測定葡萄酒中4種有機磷類除草劑的分散固相萃取-HPLC-MS/MS分析方法,分別對提取劑種類、超聲提取時間、凈化劑用量等前處理條件進行了優化。方法操作簡單、靈敏度高、準確度好,適用于葡萄酒中4種有機磷類除草劑殘留量的測定。