固相萃取凈化-超高效液相色譜-三重四極桿質譜法測定土壤中草銨膦、草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸

孫文閃,諸駿杰,鐘寒輝,董葉箐,俞 婕,劉 靜

(綠城農科檢測技術有限公司,杭州 310051)

草甘膦是一種無選擇性的除草劑,因具有低毒、廉價、高效等特點而應用廣泛。草甘膦雖然在土壤中能夠很快地與鋁、鐵等金屬的離子結合而失去化學活性,但是其會在環境和生物體內不斷富集。草甘膦和其代謝物氨甲基膦酸在通過食物和水進入人體內后,會對人體健康造成一定危害[1]。草銨膦具有低毒、雜草吸收好、活性高、殺草廣譜、環境兼容性強等特點,是世界第二大轉基因作物耐受除草劑,其速效性介于百草枯和草甘膦之間[2-4]。隨著草甘膦和草銨膦使用量的不斷上升,其對人體健康產生的風險也越來越受到廣泛關注。因此,建立一種簡單、準確、靈敏、快速地同時測定土壤中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸和草銨膦殘留的方法,可為土壤中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸、草銨膦殘留監測提供技術保障。

目前,草銨膦、草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的測定方法以液相色譜-質譜聯用法[5-16]為主流。由于草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸均為強極性化合物,具有不溶于大部分有機溶劑、難揮發、缺少熒光和發色基團、在常規反相柱上沒有保留等特點,它們不能直接通過液相色譜進行分離,也無法直接通過紫外、熒光、質譜等檢測器進行測定。有文獻通過衍生反應來改變這些物質在液相上的色譜行為并提高其在檢測器上的響應值,但是,這種方法的前處理操作程序繁瑣,衍生反應時間較長。其他的非衍生直接測定的方法報道的較少,文獻[17]采用親水色譜柱分離的液相色譜-質譜聯用法直接測定稻米中的草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的含量;文獻[18]采用反反相色譜-串聯質譜法直接測定了植物源性食品中草甘膦及其主要代謝物氨甲基膦酸的含量;文獻

[19]建立了高效液相色譜-三重四極桿質譜直接測定荔枝和香蕉中草銨膦及代謝物的方法。但是,還沒有關于非衍生液相色譜-質譜聯用法直接同時測定土壤中草甘膦、氨甲基膦酸、草銨膦含量的報道。因此,本工作建立了一種固相萃取凈化-超高效液相色譜-三重四極桿質譜同時測定土壤中的草銨膦、草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸殘留的方法,以期為土壤中草銨膦、草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸殘留的同時快速測定提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC 30A 型超高效液相色譜;8050型三重四極桿質譜儀;Oasis HLB固相萃取小柱;ST 16R 型高速離心機;T18型高速組織勻漿機;Milli-Q 型超純水儀;BSA 224S型電子天平。

草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸的單標準儲備溶液:200 mg·L-1,介質為水,于4 ℃保存。

基質匹配混合標準溶液系列:取適量草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸的單標準儲備溶液,用空白樣品溶液將其逐級稀釋成草銨膦的質量濃度為0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.5 mg·L-1,草甘膦、氨甲基膦酸的質量濃度為0.01,0.02,0.1,0.2,0.4,1.0 mg·L-1的基質匹配混合標準溶液系列。

二氯甲烷、乙腈、氨水為色譜純,乙酸銨為色譜純;草甘膦、氨甲基膦酸和草銨膦標準品的純度不小于98%;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Dikma Polyamino 氨基色譜柱(150 mm×2.0 mm,5μm),柱溫30 ℃;進樣量20μL;流量0.2 mL·min-1;流動相:A 為乙腈,B 為5 mmol·L-1乙酸銨溶液(用氨水調節pH 至12)。梯度洗脫程序:0～4.5 min 時,A 由80%降至20%,保持2.0 min;6.5～13.0 min時,A 由20%升至80%。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)負離子模式;毛細管電壓4.0 k V;霧化氣流量3.0 L·min-1,加熱氣流量10.0 L·min-1;加熱氣溫度400 ℃,離子通道管溫度250 ℃,離子源溫度300 ℃;多反應監測(MRM)掃描模式;其他質譜參數見表1。其中“?”為定量離子對。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

土壤樣品為現場采集的柱狀樣品,將其自然風干后縮分,并過孔徑為0.25 mm 的篩網。稱取上述土壤樣品(5±0.01)g于50 mL 聚丙烯離心管中,加入20 mL 水和5 mL 二氯甲烷,以12 000 r·min-1轉速高速勻漿1 min,再以10 000 r·min-1的轉速離心2 min。取固相萃取小柱,先經過5 mL水和5 mL甲醇活化,再注入上清液3 mL,收集最后1 mL的流出液,過0.22μm 水溶性濾膜,按儀器工作條件測定濾液中的3種目標化合物含量。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

草甘膦、氨甲基膦酸、草銨膦標準溶液的色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理條件的選擇

2.2.1 提取劑

由于草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸均為強極性化合物,不溶于大部分有機溶劑,故試驗以水-二氯甲烷作為提取劑,其中水可以提取土壤中的3 種目標化合物,二氯甲烷可以去除土壤中的脂溶性雜質。

4.培育了現代文明意識大家遵守的融入機制。老舊散不同于商業社區，一般是由農轉非形成的“熟人社區”，通過一系列的舉措培育社區居民的現代文明意識，能更好的發揮居民自治的參與率和成功率。通過家風家訓的征集活動、孝老愛親典型人物的評比、“二十四孝”文化墻的布置等，培育居民文明意識，回歸最真實的自我；通過義工志愿服務、鄰里幫扶濟困、社區團隊活動等，培育助人自助意識，營造鄰里一家親的和諧氛圍；通過法治宣傳、法治課堂、社區調解隊、義務巡邏等，培育居民法治意識，提高法律素養，確保社區長治久安。

2.2.2 提取方法

試驗比較了超聲提取、振蕩提取和勻漿提取等3種方法對目標化合物的提取率和提取時間的影響,結果表明:當達到相同提取率時,勻漿提取時間最短(1 min)。這是由于在高速勻漿機的轉動過程中,固液接觸面積較大,可在較短的時間內達到較好的提取效果。因此,試驗選擇勻漿提取法提取土壤中的目標化合物。

2.2.3 凈化方法

Oasis HLB固相萃取小柱采用的填料為親水親脂的反相吸附劑,可以有效去除蛋白質、脂肪、色素等物質,在抗生素[20]和激素[21]等測定中應用較廣泛。以5.0μg·L-1草銨膦和10.0μg·L-1草甘膦、氨甲基膦酸標準溶液過Oasis HLB 固相萃取小柱,得到草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸的回收率為91.8%～97.3%,說明Oasis HLB 固相萃取小柱對這3種化合物沒有保留,可以作為固相萃取凈化柱。

按照試驗方法分析加標空白樣品(草銨膦的加標量為20μg·kg-1,草甘膦和氨甲基膦酸的加標量為40 μg·kg-1),在進行固相萃取時,每隔0.5 mL收集一次流出液。結果表明:2 mL 后流出液中草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸的測定值達到最大。綜合考慮,試驗確定上清液的進樣量為3 mL,只取最后流出的1 mL進樣分析。

2.3 色譜條件的選擇

試驗考察了Waters BEH HILIC 色譜柱、Agilent ZORBAXBS-Aq色譜柱、Dikma Polyamino氨基色譜柱對草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸分離效果的影響。Waters BEH HILIC 色譜柱和 Agilent ZORBAXBS-Aq色譜柱的pH 適用范圍較窄,且得到的3種目標化合物的色譜響應不強、峰形較差。Dikma Polyamino氨基色譜柱適用的pH 為2～12,且對3種目標化合物的分離效果較好,峰形尖銳、對稱。因此,試驗選擇Dikma Polyamino氨基色譜柱對3種目標化合物進行分離。

試驗還發現,在流動相中添加乙酸銨可以改善目標化合物的峰形,添加氨水可以提高目標化合物的響應值。經過優化,確定的流動相為pH 12 的5 mmol·L-1乙酸銨-氨溶液和乙腈體系,梯度洗脫程序見1.2.1節。

2.4 質譜條件的優化

2.5 基質效應的評價

按照儀器工作條件分別測定目標化合物含量相同的基質(基質分別為砂質土、黏質土和壤土)匹配混合標準溶液和混合標準溶液,以二者峰面積的比值考察基質效應,結果見表2。

由表2可知:3種不同土壤中的基質效應存在一定的差異,可能和土壤成分的差異有關。為了提高結果的準確度,試驗選擇基質匹配混合標準溶液系列制作工作曲線。

2.6 工作曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定基質匹配混合標準溶液系列,以3種目標化合物的質量濃度為橫坐標,其對應的響應值為縱坐標繪制工作曲線,線性參數見表3。

基于空白加標的方法,以3倍信噪比(S/N)對應的加標量作為方法的檢出限(3S/N),以10S/N且回收率大于70%時對應的加標量作為方法的測定下限,結果見表3。

2.7 精密度和回收試驗

對空白樣品進行低、中、高等3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表4。

表3 線性參數、檢出限和測定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

表4 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表4 可知:3 種目標化合物的回收率為77.5%～92.0%,RSD 為5.9%～9.0%。

2.8 樣品分析

運用此方法對5份受目標化合物污染的土壤樣品進行分析,其中草甘膦檢出量為0.623～2.430 mg·kg-1,草銨膦檢出量為0.106～1.760 mg·kg-1。

本工作采用固相萃取凈化-超高效液相色譜-三重四極桿質譜法測定了土壤中的草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸,該方法前處理簡單、快速、準確,可用于土壤中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸和草銨膦快速測定。