基于納米顆粒構建的酶聯增敏生物傳感器測定水中Cd2＋

溫麗蘋 ,李 琳 ,程云輝 ,丁 利 ,許 宙?

(1.長沙理工大學化學與食品工程學院,長沙 410114;2.湘潭大學化工學院,湘潭 411105)

重金屬污染是一個全球性問題,鎘是一種常見的重金屬元素,主要應用于油漆著色、鎳鎘電池和電鍍等工業領域,因此廣泛分布于空氣、水、土壤等環境中[1]。鎘是一種累積毒素,經食物鏈和水攝入,在肺、腎和肝臟等人體器官中積累后,會對人體的腎臟、肝臟、心血管、神經等方面造成損害[2-5]。以尿鎘計,鎘的生物半衰期男性為11～19 a,女性為18～35 a[6]。鎘污染已經嚴重威脅到人類健康,已被列為環境與食品污染的主要公害之一[7]。世界衛生組織和美國環境保護署規定飲用水中Cd2＋的限量標準為3μg·L-1[7-8]。因此,對水樣中低含量Cd2＋的測定要求越來越高。迄今為止,已開發出許多方法用于測定環境和生物樣品中Cd2＋的分析,如原子吸收光譜法[9]、電感耦合等離子體質譜法(ICPMS)[10]、表面增強拉曼光譜法[11]、電感耦合等離子體原子發射光譜法[12-13]等。但這些分析方法常需要專業人員操作,且存在耗時長、成本高、操作復雜等問題,因此迫切需要建立一種低成本的快速測定Cd2＋的方法,這對環境監測和保障人身健康至關重要。

近幾十年來,隨著納米科技的發展,納米材料由于具有靈敏度高、特異性好、快速經濟的突出優勢,用于物質快速分析的研究受到了人們的廣泛關注[14-15]。如基于超順磁性和親和分離原理的磁性納米材料已成功地應用于脫氧核糖核酸(DNA)、多糖、蛋白質、重金屬及毒素等的測定[16-19]。近年來,由于抗原-抗體的免疫識別作用可以有效地提高測定方法的特異性,關于綜合利用磁性納米材料與其他納米材料,并結合抗原-抗體的特異性免疫識別作用構建競爭性免疫傳感器用于測定毒素、細菌的研究相繼被報道[20-21]。

基于此,本工作擬利用磁納米顆粒和金納米顆粒(Au NPs)為載體,表面分別進行鎘-抗原和鎘-抗體的功能化,并于功能化Au NPs表面修飾乙酰膽堿酯酶(ACh E),從而構建了ACh E 酶聯增敏生物傳感器。方法基于抗原-抗體的免疫識別作用驅動磁納米顆粒和Au NPs發生競爭性自組裝形成組裝體,組裝體催化底物乙酰膽堿(ACh)水解產生乙酸,引起反應體系的酸度變化,實現對Cd2＋的高特異性與高靈敏度的測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

PHBJ-260型pH 計;JEOL JEM-2100 型透射電子顯微鏡(TEM);Zetasizer nano型激光粒度儀;85-2型數顯恒溫磁力攪拌器;HH-WO-2型恒溫油水浴鍋;TG16-WS型臺式高速離心機。

Cd2＋標準溶液:1.0μg·L-1。

pH 7.4的0.05 mmol·L-14-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖溶液:將2.38 g(10 mmol)HEPES溶于180 mL水中振搖至全溶,一邊攪拌一邊緩慢滴加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液至pH 為7.4,然后用水定容至200 mL。

所用試劑均為分析純,試驗用水為超純水。

1.2 試驗原理

Fe3O4磁納米顆粒用鎘-抗原進行功能化修飾,Au NPs用鎘-抗體和AChE進行功能化修飾。當體系中不存在Cd2＋時,大量ACh E 修飾的功能化Au NPs與功能化Fe3O4結合,磁分離后,Fe3O4-抗原-抗體-Au NPs-AChE 組裝體催化底物ACh 水解產生大量乙酸,引起體系反應前后較大的pH 變化(反應前后的pH 差值以ΔpH 表示);而隨著Cd2＋的增加,Cd2＋會和功能化Fe3O4產生競爭,被功能化Au NPs 上的鎘-抗體特異性識別,磁分離后,Fe3O4-抗原-抗體-Au NPs-AChE 組裝體減少,其催化底物ACh水解引起體系的ΔpH 較小?；诖嗽?可根據反應體系ΔpH 與Cd2＋的含量繪制標準曲線,實現對Cd2＋的測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 Fe3O4磁納米顆粒的制備及其功能化修飾

采用水熱法[22]合成Fe3O4磁納米顆粒:于燒杯中加入15 mL 乙二醇,分別添加1.2 g 乙酸鈉和0.5 g六水合氯化鐵攪拌至溶解,稱取0.375 g聚乙二醇繼續加入上述混合液中,攪拌4 h使其充分溶解。將該溶液全部轉移到聚四氟乙烯內膽中,并置于不銹鋼反應釜中,于210 ℃油浴鍋中加熱反應12 h。待反應釜冷卻后,將得到的黑色產物用無水乙醇和水各洗滌3次,并于無水乙醇中保存備用。

抗原功能化Fe3O4(Fe3O4-抗原)的制備:將文獻[23-24]報道的方法做適當調整,取200μL 上述制備的Fe3O4溶液于離心管中,加入25 μL 的0.6 g·L-11-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽溶液和25μL的0.4 g·L-1硫代羥基琥珀酰亞胺溶液混勻作為A 液;將20μL的0.1 g·L-1鎘-抗原溶液加入到980μL 的0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)中作為B 液。將以上A、B 兩種溶液混合,室溫下搖床孵育反應1.5 h 得到Fe3O4-抗原,以6 000 r·min-1轉速離心10 min,用適量0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)洗滌一次后將沉淀物復溶于1 mL 的10 g·L-1牛血清白蛋白溶液中,于4 ℃保存備用。

1.3.2 Au NPs的制備及其功能化修飾

采用檸檬酸鈉還原法[25]制備Au NPs:取97.5 mL水及2.5 mL的1 mmol·L-1氯金酸溶液加入到錐形瓶中,高速磁力攪拌加熱至沸騰,保持7～8 min后迅速加入2 mL的10 g·L-1檸檬酸三鈉溶液,加熱15 min后,持續攪拌約15 min,冷卻至室溫,于4 ℃保存備用。

抗體功能化Au NPs(Au NPs-抗體)的制備:用pH 8.0的0.002 mol·L-1硼酸鹽緩沖溶液將抗體稀釋至6 mg·L-1,取1 mL 作為C 液備用;另取1 mL制得的Au NPs溶液并向其中加入8μL 的0.1 mol·L-1碳酸鉀溶液混勻,作為D 液。將上述C、D 兩種溶液混合,室溫下搖床孵育50 min后加入50μL 100 g·L-1的牛血清白蛋白溶液,在室溫下搖床孵育2 h。將孵育后的混合物以7 000 r·min-1轉速離心25 min,并將沉淀物重懸于含有50 g·L-1海藻糖的0.002 mol·L-1硼酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)中,于4 ℃保存備用。

ACh E修飾Au NPs-抗體(ACh E-Au NPs-抗體)的制備:將50μL Au NPs-抗體溶液與10μL 的1 g·L-1ACh E溶液混合均勻,黑暗環境中于室溫搖床孵育2 h,以6 500 r·min-1轉速離心15 min,棄去上清液,沉淀物重懸于50μL水中備用。

1.3.3 螯合劑的制備

游離的Cd2＋不能被鎘-抗體直接識別,需先將Cd2＋與乙二胺四乙酸反應生成螯合物,才能與抗體結合。

將0.05 mol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)和50 mmol·L-1的乙二胺四乙酸溶液以體積比10∶1混合均勻作為螯合劑。取50μL 的待測水樣加入到離心管中,并向離心管中加入50μL 上述螯合劑,于室溫下搖床孵育2 h。

1.3.4 ΔpH 的測定

分別移取50 μL Cd2＋標準溶液和30 μL Fe3O4-抗原溶液混合均勻,加入100μL 的ACh EAu NPs-抗體溶液,室溫下搖床孵育反應1 h,磁分離后除去上清液,重懸于200μL 的25 mmol·L-1ACh溶液中,水解1 h,用pH 計測定水解前后體系的Δp H。

2 結果與討論

2.1 材料的表征

納米材料的尺寸、粒徑、分散性會直接影響納米材料在功能化修飾和特異性結合時的效果[26]。Au NPs、Fe3O4、Au NPs-Fe3O4復合物的TEM 圖見圖1。

由圖1可知:制備的Au NPs、Fe3O4分散性較好,顆粒大小相對均勻,其平均粒徑分別為13,125 nm;當體系中沒有Cd2＋存在時,功能化Au NPs和功能化Fe3O4通過抗原-抗體間的特異性識別順利組裝,得到Au NPs-Fe3O4復合物,其平均粒徑為140 nm。

圖1 Au NPs、Fe3O4、Au NPs-Fe3O4復合物的TEM 圖Fig.1 TEM images of Au NPs,Fe3O4and Au NPs-Fe3O4complex

動態光散射測得的材料的平均粒徑(水合粒徑)一般比材料的實際粒徑略大,這是因為動態光散射測得的是材料的流體動力學直徑[27],但該表征方法仍可用來分析納米顆粒的尺寸變化。

Au NPs、Fe3O4、Au NPs-抗體、Fe3O4-抗原和Au NPs-Fe3O4復合物的水合粒徑見圖2。

圖2 Au NPs、Fe3O4、Au NPs-抗體、Fe3O4-抗原和Au NPs-Fe3O4復合物的水合粒徑Fig.2 Hydrated particle sizes of Au NPs,Fe3O4,Au NPs-antibody,Fe3O4-antigen and Au NPs-Fe3O4complex

由圖2可知:所合成的Au NPs和Fe3O4的水合粒徑均呈正態分布,平均水合粒徑分別為22,510 nm;Au NPs-抗體和Fe3O4-抗原的平均水合粒徑分別增加至46,613 nm;當沒有Cd2＋存在時,Au NPs-抗體和Fe3O4-抗原通過抗原-抗體間的特異性識別作用形成Au NPs-Fe3O4復合物,平均水合粒徑增加到740 nm。

2.2 標準曲線和檢出限

用水將1.0μg·L-1Cd2＋標準溶液依次稀釋成0.001,0.020,0.050,0.100,0.200,0.500,1.00,2.00,5.00,10.0μg·L-1的Cd2＋標準溶液系列。按試驗方法測定Cd2＋標準溶液系列的Δp H,將ΔpH 與Cd2＋的質量濃度(ρ)進行擬合,繪制標準曲線。結果表明:反應體系的ΔpH 與Cd2＋質量濃度的對數值lnρ成負相關,Cd2＋的線性范圍為0.001～10.0μg·L-1,線性回歸方程為y＝-0.177 8 lnρ＋0.504 0,相關系數為-0.997 0。

以平行測定10次的空白樣品的3倍標準偏差(s)除以標準曲線斜率(k)計算方法的檢出限(3s/k),結果為0.24 ng·L-1。

幾種基于納米材料測定Cd2＋的方法參數對比見表1。

由表1可知:將酶聯增敏法(本方法)與基于納米材料測定Cd2＋的其他方法進行比較,本方法的檢出限較低,具有一定的優勢。

2.3 特異性試驗

為評價制得的酶聯增敏生物傳感器(Cd2＋傳感器)的特異性,選用Cu2＋、Hg2＋、Zn2＋、Pb2＋、Co2＋作為可能存在的共存重金屬離子進行特異性試驗。分別配制10μg·L-1的Cu2＋、Hg2＋、Zn2＋、Pb2＋、Co2＋標準溶液,按試驗方法測定其Δp H。結果表明:Cd2＋、Cu2＋、Hg2＋、Zn2＋、Pb2＋、Co2＋的ΔpH 依次為0.92,0.03,0.02,0.01,0.03,0.01?？梢钥闯?該酶聯增敏生物傳感器對10μg·L-1的其他重金屬元素響應較弱,故Cd2＋測定方法特異性良好。

表1 幾種基于納米材料測定Cd2＋的方法參數對比Tab.1 Comparison of parameters obtained by several determination methods for Cd2＋based on nanomaterials

2.4 回收試驗

移取適量空白的自來水樣品、湖水樣品和池塘水樣品,用0.22μm 濾膜將水樣過濾,在14 000 r·min-1轉速下離心15 min,去除水樣中可能存在的懸浮顆粒物。按試驗方法對上述過濾、離心后的空白水樣進行加標回收試驗,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),同時,采用ICP-MS[33]進行測定,樣品分析結果見表2。

表2 樣品分析結果(n＝10)Tab.2 Analytical results of the samples(n＝10)

由表2可知:本法的回收率為91.2%～107%,RSD 為3.5%～5.4%;本法的測定結果與ICP-MS的測定結果基本一致,本法可用于實際水樣中Cd2＋的測定。

本工作以Fe3O4磁納米顆粒和Au NPs為載體,利用抗原-抗體的特異性識別作用構建了AChE聯增敏生物傳感器測定Cd2＋。方法具有簡便快速、特異性好、靈敏度高、成本低的特點,可用于Cd2＋的快速測定。