基于中醫方劑的活性組分篩選的研究策略與思考*

任周新，李君，劉海軍

1.河南中醫藥大學中醫藥科學院，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心，河南 鄭州 450046；3.河南牧業經濟學院，河南 鄭州 450044；4.河南省中醫藥防治呼吸病重點實驗室，河南 鄭州 450046

組分一詞用于中醫藥研究，較早零星出現于中藥化學成分分析和藥效學研究文獻中［1-3］。張伯禮和王永炎在方劑學研究的總體假說中，首次提出方劑的治療內核在于方劑中的藥物組分，這些組分通過拮抗、補充、整合和調節等作用，對體內的復雜靶點進行干預，產生整體的治療效應［4］。此后，組分研究得到中醫藥學界的重視，發展迅猛，成為中醫藥研究的熱點。目前認為：中藥組分來源于中藥材的有效部位或部位群，是具有一定比例化學成分群構成的組合物［5］。傳統方劑配伍的基本單元為中藥飲片等天然藥材，與之比較，組分具有化學成分可識別，成分比例相對固定，活性一般可表征和重復性好等優點。

方劑組分的研究逐漸集中于兩個方向：一是以中醫理論為指導，將不同的中藥組分配伍，產生相應的藥性特征（性、味和歸經等），這樣的組分方劑，服務于中醫臨床，針對中醫臨床癥狀和證產生防治效應。二是根據臨床應用，選擇對西醫所述某種疾病（如慢性阻塞性肺疾病等）有良好療效的方劑，應用藥物化學、分析化學等方法提取該方劑的有效組分，以臨床前的藥效學和藥代動力學等研究手段評估組分效果，進而篩選出具有潛在療效的天然藥物。本文對后者近些年來的研究成果進行歸納，概括和分析其中的研究策略，期望對未來的研究提供指導和幫助。

1 方劑的確定

方劑有效組分研究的第一步，是收集和完善目的研究疾病相關方劑的信息。之后，應用數據分析技術和信息處理技術分析、處理上述信息，篩選、形成研究用方劑。

1.1 信息的獲取根據信息載體的模式，方劑的信息來源主要有印刷形（包括圖書、期刊和其他文獻）和數字形信息。圖書包含工具書，如《中華人民共和國藥典》《中醫方劑大辭典》［6］《中藥大辭典》等，以及專著類，如經典專注《金匱要略》《太平惠民和劑局方》《本草綱目》等以及現代著作如《中醫肺病方劑辭典》［7］《名老中醫臨證經驗擷英》［8］等。期刊信息量豐富，高質量的期刊論文引領方劑學科的發展、緊跟學科學術發展的前沿，是方劑藥物組分研究領域的重要信息資源。高水平方劑研究的專業期刊有《中國實驗方劑學雜志》《中醫雜志》《中國中西醫結合雜志》《中國中藥雜志》以及國外的《Journal of Ethnopharmacology》《American Journal of Chinese Medicine》等。其他方劑研究文獻資源包括科技報告、學位論文、產品說明書、專利說明書、標準文獻、會議文獻等。

數字形信息包括數據庫資源和電子期刊，具有信息內容廣泛、報道及時、形式多樣以及查找、存貯、應用便捷等特點，已經成為科研人員獲取、利用信息的主要形式。國內的專業數據庫和電子期刊有中國中醫藥數據庫（中國中醫科學院中醫藥信息研究所）、中國知網（CNKI，China National Knowledge Infrastructure）、萬方數據資源系統等；國外的有PubMed醫學文獻檢索服務系統（美國國立醫學圖書館）以及Web of Science數據庫等。

在查閱上述文獻信息的基礎上，經過用語規范、信息納入和排除等步驟，設計、構建專用的數據庫，以利于后期的數據挖掘和目的方劑組成的確定。

1.2 信息挖掘及目的方劑的組成隨著數據分析技術和信息處理技術的快速發展，越來越多先進的數據挖掘工具被應用于方劑配伍規律的研究之中，為探索治療疾病的特定方劑中核心藥物的組成，提供了具有潛在價值的重要信息。如以某些網站上醫患互動論壇上的鼻炎相關問答帖為數據來源，采用中文文本分詞、數據清洗、詞頻統計、相關分析等文本挖掘的方法，分析鼻炎的相關用藥，發現玉屏風散在鼻炎并發咽炎的治療中應用較廣［9］。將這種方法用于分析中醫治療肺癌的規律，發現人參與麥冬的組合、黃芪與白花蛇舌草組合、黃芪與沙參組合，在臨床治療中出現的頻率較高［10］。

李建生等［11］利用已經建立的現代名老中醫肺病數據庫（計算機軟件著作權編號0430655）和中醫肺病數據庫，應用聚類分析和二元相關分析的方法，發現肺氣陰兩虛證常用方劑有麥門冬湯和炙甘草湯，常用藥物有麥冬、甘草、半夏，常用藥對有熟地黃與石斛、枇杷葉與石膏、枇杷葉與熟地黃；肺陰虛證常用方劑為麥門冬湯，常用藥物有麥冬、甘草、南沙參；常用藥對有生地黃與黨參、麥冬與半夏、知母與化橘紅；痰熱壅肺證常用方劑為千金葦莖湯，常用藥物有苦杏仁、川貝母、甘草，常用藥對為竹茹與蘆根、桔梗與枳殼、川貝母與枇杷葉；肺氣虛證常用方劑為獨參湯，常用藥物為黃芪、白術，常用藥對有黃芪與牡蠣、丹參與當歸、太子參與白術；肺胃陰虛證常用方劑為現代名老中醫自擬方，常用藥物有茯苓、甘草、川貝母，常用藥對有砂仁與蓮子、半夏與化橘紅、陳皮與南沙參；痰瘀阻肺證常用方劑為香附旋覆花湯，常用藥物有半夏、黨參、紅花，常用藥對為丹參與赤芍、丹參與桃仁、枇杷葉與百部。

上述研究所確定的方劑或藥物組合，可以直接作為下一步方劑組分的研究目標。另外，也可以根據中醫對某種疾病的認識，如肺腎氣虛是慢性阻塞性肺疾病穩定期的常見證之一［12］，治則為補益肺腎，納氣平喘，選擇符合治則又出現頻率較高的藥物，以君臣佐使重新組合，組成新的方劑，進行下一步的研究。

2 方劑組分的篩選

中醫方劑主要以多種藥材共同水煮制備成煎劑，然后供給臨床應用。若無特殊要求，方劑有效組分的研究應以目的方劑的水煎液為組分分離的對象。來源于自然界的中藥材含有復雜的化學成分，包括有效成分、無效成分、毒性、功能成分等。

2.1 組分分離-藥效學驗證模式有效組分的篩選，首要的工作是分離出煎液中的不同組分。簡單、經濟的初篩方法，是利用化學分子極性的差異，利用極性不同的溶劑分離、提取不同的組分。常見的方法有水提醇沉法和醇提水沉法，其后，用極性不同的溶劑進一步分離組分。上述分離得到的組分，進行藥效學初篩，以母方煎液作為陽性對照，剔除反應陰性的組分，保留陽性的組分。陽性的組分進行色譜分離、大孔吸附樹脂分離等方法，進一步分離純化，不同的組分再次進行藥效學驗證，直至分離純化為不同的化學分子，并最終找到反應陽性的單一化合物。這種模式，是從天然藥物中篩選有效成分的常規模式，在中藥有效成分的發現中應用廣泛，標志性的成功案例就是屠呦呦發現的青蒿素。

上述模式可用于方劑有效組分的研究，但也要考慮中醫方劑臨床應用的特色：即強調多靶點的藥物干預和多臟器功能的調節。因此，有效組分的分離不宜過細，達到質量可控的有效部位即可，如生物堿類、多糖類。這種思路，在“單行”方劑的研發中，得到成功的應用，如血栓通（三七的總皂苷組分）等已經作為藥典所載的藥物上市。

2.2 無效組分剔除-藥效學驗證模式盡管組分分離-藥效學驗證模式是目前方劑有效組分篩選中通用的方法，也能從方劑中找到藥效強、針對主要疾病的組分，闡釋方劑君藥作用的物質基礎。但這種方法割裂了方劑中不同組分之間復雜的交互作用，不能闡釋復雜組分相互之間的協同作用、減毒作用及拮抗作用等重要信息。組分剔除-藥效學驗證模式對此進行改良［13］，能夠在一定程度上揭示方劑中復雜組分之間的交互作用。

該方法將方劑煎液分離成多個組分，相應的去除了某個組分的剩余組分，組分、剩余組分與煎液的關系表述如下：

F（煎液）-F（n）組分＝F（n）剩余組分

剩余組分和煎液同時進行藥效學實驗，得到相應的效應強度（S）。結果進行方差分析：第一步，藥物組與對照組進行方差分析，計算各藥物組與對照組之間的P值，標記為P（x）（n）；第二步，計算各藥物組與煎液組之間的P值，標記為P（y）（n）；第三步，根據藥效結果和前兩步的結果，按照下列關系式進行判斷：①S（煎液）＞S（a）剩余組分，且P（y）（a）剩余組分＜0.05，則組分a是方劑的有效組分；②S（煎液）＞S（b）剩余組分，且P（y）（b）剩余組分＞0.05，但P（x）（煎液）＜0.05且P（x）（b）剩余組分＞0.05，則組分b是方劑的有效組分；③S（煎液）＜S（c）剩余組分，且P（y）（c）剩余組分＞0.05，但P（x）（c）剩余組分＜0.05，需要再次實驗證明被剔除的c組分是否是方劑的有效組分；④S（煎液）＜S（d）剩余組分，且P（y）（d）剩余組分＜0.05，則組分d是無效成分，剩余組分間可能存在協同增效的相互關系。

如果目的方劑煎液分成了上述4個組分，則可判斷出組分a是方劑的“君”組分，組分d是無效組分，應剔除。除去d后的剩余組分包含a、b和c，可能存在協同作用。再次進行試驗，設組分a組、剔除d的組分組和煎液組，如果剔除d組分組的效果顯著高于a組，P值小于0.05，則可認為組分a、b和c配伍，存在協同增效的交互作用。

俞凌燕等［13］應用組分剔除-藥效學驗證法研究參麥方對環磷酰胺化療S180荷瘤小鼠的增效作用，發現人參二醇抑瘤率最高，從而找到了方中君藥的有效組分；人參二醇、人參三醇和麥冬多糖合用，具有協同增效作用；麥冬皂苷是無效組分，應剔除。上述結果，從輔助環磷酰胺抑瘤的角度，清晰地闡明了參麥方的君藥組分（人參二醇）和無效組分（麥冬皂苷）；初步證明人參二醇等3組分合用的協同增效作用，利于下一步的方劑配伍的研究。

2.3 反向藥理學模式隨著對疾病發生發展過程的深入認識，發現某些蛋白質表達的變化是制約或促進疾病進展的關鍵因素。隨著基因組學、蛋白質組學等學科的進步，持續不斷的基因序列和蛋白質序列及結構等信息被發現，生物信息學處理、運算這些信息，識別出與疾病密切相關的蛋白質分子，這些分子成為藥物研究的靶標。由此，一種新的篩查藥物的新方法—反向藥理學形成并得到了應用。

應用反向藥理學篩選藥物組分，主要的步驟如下［14］：第一步要確定藥物作用的靶蛋白分子。根據配體-受體理論，這些決定了疾病發生、發展的蛋白質分子相當于受體，能夠與之結合并產生一定相互作用的化合物分子，才可能成為可能的藥物。第二步是用這些蛋白質作為“魚餌”，測試待篩化合物是否與之結合，并影響其表達變化；這個過程也稱為“配體鉤釣”。第三步，那些被“釣”到的化合物分子，再進行藥效學、毒理學和臨床藥學等研究。

反向藥理學適合復方或草藥初提物篩選有效組分。原因在于這些初提物（如方劑的水煎劑）已經臨床應用較久，治療的疾病或癥狀清楚，靶蛋白探尋的目標較為明確。但這些初提物含有復雜的組分，傳統的組分提取-藥效學篩選費時耗力。借助反向藥理學發現靶蛋白的變化，根據其推導的配體分子結構，查詢相應的植物化學成分數據庫，較快確定可能的有效組分范圍，提高篩選效率。

芪藶強心膠囊由黃芪、人參、葶藶子等十余種中草藥提取、制備，是一種上市的治療心衰的中成藥，含有復雜的組分。Fu Junzeng等［15］檢測藥物治療心衰大鼠血清中9種生物蛋白和147種代謝產物，借助于KEEG數據庫和Boehringer代謝圖等生物信息學分析技術，推導藥物的效應涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統、溶血磷脂酸/溶血磷脂酸環狀類似物通路等復雜體系的調節，確定氧脂素類（oxylipins）等是藥物作用的靶蛋白，為進一步篩選復方中的有效組分縮小了范圍。龍血竭是傣族常用的一種草藥，具有止痛功效。劉向明等［16］設想龍血竭鎮痛的可能靶蛋白是感覺神經元中特異的電壓門控鈉通道。以大鼠DRG細胞的TTX-S和TTX-R鈉通道為靶蛋白，觀察藥物干預后，通道電流的變化。結果發現，總提取物及有效成分龍血竭素B調節TTXS的電流；盡管提取物調節TTX-R的電流，但未發現任何一種成分有此作用，而劍葉龍血素A、劍葉龍血素B和龍血素B的組合物具有類似的調節作用。該發現初步發現了龍血竭鎮痛的有效組分。

3 計算機虛擬篩選的應用

3.1 類藥性篩選在新藥的研發過程中，過去人們重視所篩查化合物分子的靶點選擇性和活性強度，忽視其藥代動力學性質和生物利用度的先期評估，導致這些問題在研發后期（如臨床研究階段）出現，造成研發經費的激增甚至研究的終止，形成人力和物力的浪費［17］。為了規避上述弊端和減少新藥研發的風險，基于對已知藥物分子化學結構、物理化學性質和生物學特性等的歸納總結，人們總結出它們的某些經驗性特征，提出了類藥性的概念并應用于早期的篩選化合物的藥代動力學性質及其生物利用度的預測。其中，Lipinski類藥五原則已經成為篩選的重要標準［18-20］，該原則認為：化合物的分子量小于500道爾頓；化合物結構中的氫鍵給體（包括羥基、氨基等）數量不超過5個；化合物中氫鍵受體的數量不超過10個；化合物的脂水分配系數的對數值（logP）在-2-5之間；以及化合物中可旋轉鍵的數量不超過10個。隨著人們對藥物化合物分子類藥性認識的深入，該原則也在不斷地優化。

中草藥藥物分子的化學結構具有一些自身的特點。數十年來，國內的研究也積累了豐富的結構、生物利用度、藥代動力學等數據。基于此，王永華等［21］開發出中藥系統藥理學研究平臺，逐漸完善形成具有自主知識產權的系統藥理學分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），在植物藥/中藥研究中得到了廣泛的應用。該軟件中的兩個工具：類藥性（Drug-like，DL）和口服生物利用度（oral bioavailability，OB））在復方篩選中得到了普遍的應用。

金銀花與連翹是治療溫病常用的組合，在復方配伍中屬于相須，臨床應用廣泛。吳嘉瑞等［22］應用TCMSP，檢索到金銀花和連翹含有365個化合物分子。系統可顯示出每個成分的OB值和DL值，以OB＞50%和DL＞0.18作為篩選條件，得到16個候選化合物。丹參與三七是另一組臨床常用的治療血瘀證的經典藥對。師帥等［23］應用TCMSP，從中查詢到312個化合物分子，以該軟件推薦的ADME參數進行篩選，即：OB≧0%和DL≧0.18，得到73個候選成分。丁燕等［24］應用TCMSP，從藥食同源的15種中藥（茯苓、蓮子、山楂、枸杞子等）找到1502個化合物分子，按照OB≧0%和DL≧0.18篩選，得到361個候選成分。

3.2 靶點-分子對接篩選藥物分子與體內特定蛋白（靶蛋白）的結合，是藥物產生效應的基礎。這種結合類似于配體-受體間的相互作用，具有一定的規律性，是結合分子間空間結構匹配和能量匹配綜合作用的結果，受到結合分子間靜電作用、氫鍵作用、疏水作用及空間構象等的影響。通過對分子構象、分子間作用力的計算，可以預測藥物與靶蛋白之間的結合程度，逐漸形成了分子對接技術。目前，以某個或某些靶蛋白作為受體，借助分子對接技術計算不同化合物分子與之結合的程度，按照程度的高低進行篩選，從中藥復方的復雜成分中獲取候選化合物，已經成為復方組分篩選的重要策略之一。

雌激素類藥物是防治絕經后婦女骨質疏松癥的常用藥物，但長期應用不良反應較多。藥食兩用的某些中藥臨床上用于治療骨質疏松癥，但其有效組分和作用靶點尚未闡明。丁燕等［24］選擇15種藥食同源的中草藥；以11個雌激素樣蛋白作用受體，應用分子對接技術分析藥材的1502個化合物與受體的結合，以對接評分≧5為標準，找到336個潛在活性成分。隨后建立的化合物-靶標蛋白網絡進一步顯示黑芝麻和枸杞的潛在活性成分與靶蛋白的作用最為密切。借助分子對接技術，不僅發現了潛在的活性成分和揭示出雌激素樣受體干預是某些藥食兩用中藥治療絕經后婦女骨質疏松癥的可能內在機制，而且證實了黑芝麻和枸杞在該病治療中的價值。林桂源等［25］查詢了78種降血糖中藥，找到了2401種化合物分子。借助于DrugBank數據庫，確定了7個糖尿病治療相關蛋白作為分子對接的靶蛋白。在Sybyl軟件的Surflex-Dock模塊，將化合物分子分別與靶蛋白進行柔性對接，利用Surflex-Dock模塊的Total-Score打分函數對化合物分子與靶標的相互作用進行評分，設置7分為閾值。結果發現：52、28、32、150、47、41和33個成分分別與二肽基肽酶-Ⅳ、糖原合酶激酶-3、過氧化酶增殖因子活化受體γ、α-葡萄糖苷酶、葡萄糖激酶、鈉-葡萄糖共轉運蛋白2和血管緊張素轉化酶較好結合。該結果對糖尿病治療新藥的研究與開發具有一定的參考價值。

3.3 網絡藥理學的應用當前，復雜性疾病成為威脅人類健康和生命的重要疾病。人們認識到這類疾病由多個基因或分子位點參與，受到環境因素的影響，表型差異較大。傳統的單一分子靶點的高特異性藥物治療這類疾病，效果不佳。從網絡藥理學的角度，正常條件下，人體的某項生命活動處于眾多的蛋白質、基因及其他分子表達和功能所形成的網絡的平衡狀態，復雜疾病導致該網絡平衡的破壞而非網絡中某個單一靶點的異常，改善或恢復該網絡的平衡是藥物產生治療效應的基石。網絡藥理學不僅能夠預測中藥復方復雜的作用機制，也可用于有效組分的篩選。陳浩等［26］在TCMSP網上查詢梔子，搜索到98個化合物，經過類藥性篩選后，得到21個候選化合物。將21個化合物與其作用靶點導入Cytoscape軟件中，構建活性成分-靶點網絡，按照自由度大小篩選出核心成分，依次為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、熊果酸、西紅花酸、歐前胡素、丁香脂素、京尼平、亞油酸乙酯、蘆丁和齊墩果酸。如果將梔子活性成分與膽汁瘀積疾病靶點構建成分-靶點-疾病網絡，篩選出核心網絡，并從中篩選出7個核心成分，依次為豆甾醇、山柰酚、β-谷甾醇、槲皮素、歐前胡素、西紅花酸和熊果酸。綜合兩種篩選模式可以看出，上述7種成分與梔子治療膽汁瘀積性疾病關系更為密切，它們之間相互作用的配伍關系的研究，有助于闡釋梔子作用的內在規律。

3.4 計算機虛擬篩選技術組合的應用上述篩選復方中有效組分的計算機虛擬技術，根據篩選目的，可單獨應用，但更多的是組合在一起，序貫使用。

西黃方用于乳腺癌的治療，已有數百年的歷史，該方由乳香、沒藥、牛黃和麝香組成。Hao J等［27］通過Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology（TCMSP）數據庫（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）查詢上述4藥的化學成分，通過Lipinski’s原則對上述化合物進行類藥性篩選，得到候選化合物。將候選化合物代入ChemMapper（http：//lilab.ecust.edu.cn/chem mapper/）中，預測西黃方作用的靶點，建立西黃方成分靶點數據庫。從Therapeutic Target Database（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd＿home.asp）和其大量的引用研究文獻中，篩選得到120個乳腺癌靶點，建立乳腺癌靶點數據庫。從乳腺癌靶點數據庫和西黃方成分靶點數據庫中，找到相同或相似的乳腺癌靶點（交集靶點）。應用Cytoscape software建立成分與交集靶點的相互關系，接著用CentiScaPe plugin計算這些關系的拓撲學參數，以total predicted scores＞0.5和single predicted score＞0.01作為篩選條件，建立各單藥主要活性成分與靶點的關系；從中發現最重要的兩個靶點是雌激素受體ɑ（ERɑ）以及熱休克蛋白90（HSP90）；在SystemsDock中，分別進行活性成分與兩個靶點的分子對接。結果發現，麝香和牛黃作用微弱，西黃方中的抑制乳腺癌的藥物是乳香和沒藥。沒藥的主要活性成分是沒藥甾酮類、沒藥醇類，共同的靶點為ERɑ，其他涉及的靶點有Akt、熱休克蛋白90等，活性成分具有共同的甾環結構環戊烷并氫化菲。乳香的活性成分為乳香酸類，共同的靶點是熱休克蛋白90，共同的化學結構是五環三萜。

在隨后進行的實驗中，等溫滴定兩熱法證實沒藥甾酮（Guggulsterone，GS）與ERɑ之間結合緊密，結合力類似于雌二醇。GS、20α-hydroxy-4-pregnen-3-one（20αHP）、fulvestrant和tamoxifen，對ER陽性表達的乳腺癌細胞增殖有抑制效果，但對陰性表達的細胞增殖，如SKBr3或MDA-MB-231，沒有影響。乳香中的活性成分（Acetyl-β-boswellic acid，Acetyl-α-boswellic acid和β-boswellic acid）對上述4種腫瘤細胞的增殖，均有抑制作用且不同細胞間差異不明顯，類似于HSP90的抑制劑tanespimycin（17-AAG）。

迄今為止，人們掌握了許多中藥材中所含化學成分的基本信息，知曉一個復方中所含的幾乎所有化合物分子。無論是組分分離-藥效學驗證模式還是無效組分剔除-藥效學驗證模式，對一個含有數百至上千的成分進行藥效學篩選，都將是低效的方式。網絡藥理學通過建立組方中的化學分子作用靶標和疾病靶標，通過兩者的交集確定藥物作用的靶分子，建立成分-靶分子網絡。借助網絡分析技術，找出最為關鍵的靶點及組分，解決了候選分子及靶點難以選擇的難題。隨后根據靶點對候選分子進行分子對接、類藥性等篩選，進一步提高了篩選的成功率。因此，上述虛擬篩選技術的聯合應用顯著減少了化合物篩選的時間、降低了無目的篩選實驗所導致的人力和物力消耗。與之前常常用于多成分化合物篩選的高通量法比較，虛擬篩選后所進行的活性篩選實驗，得到5-30%的陽性率，遠遠高于高通量篩選的0.01-0.1%的陽性率［28］。因此，虛擬篩選技術在中藥復方研究中的應用日益廣泛［27，29-31］。

4 啟示與展望

上述文獻的回顧和分析，顯示出：①先期開展方劑組分的計算機虛擬技術篩選，在未來的研究中，可能成為不可避免的步驟。②數據的分析和應用，成為方劑組分篩選的關鍵。

但目前的數據存在某些問題，某些組分信息較少甚至沒有，反映了組分信息尚未滿足方劑組分篩選的需要。另一方面，需要避免噪音信息的干擾。筆者發現某些組分的陽性研究報告或論文存在結果不能重復的問題。顯然，這些陽性信息的納入分析，可能導致整個分析結果的失準，甚至錯誤，有必要加強輸入信息的質量控制。最后需要指出的是：計算機虛擬技術篩選，盡管成為組分篩選的重要方法，但不能取代藥理學研究結果。藥理學實驗結果仍然是判斷方劑有效組分篩選結果最為可靠的標準。