葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎作用機制研究*

厲越，高凌卉，劉瑤萍，韓昌鵬

1.上海中醫藥大學附屬岳陽臨床醫學院，上海 200080；2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200080

潰瘍性結腸炎是涉及異常免疫反應的腸道慢性炎癥，臨床可表現為腹瀉、腹痛、便血等。其累及部位主要涉及直腸和乙狀結腸，嚴重者可侵及整個結腸。潰瘍性結腸炎目前的治療方案已出現巨大進步，維多珠單抗等藥物的出現為潰瘍性結腸炎患者帶來新的曙光。但目前潰瘍性結腸炎治療存在復發率高，療效不穩定，價格較高等問題，給個人和社會帶來一定負擔。

中藥治療潰瘍性結腸炎療效確切，給患者帶來新的選擇。葛根芩連湯出自張仲景《傷寒論》，由葛根、黃芩、黃連、甘草4味藥組成。《方劑學》［1］載葛根芩連湯主治濕熱痢疾，表現為便膿血赤白相兼，且腹痛，里急后重較甚，有清熱燥濕、調和氣血之功，兼能通滯下行，已被廣泛應用于治療腹瀉相關疾病，如潰瘍性結腸炎等，并取得良好療效。許愛軍［2］使用葛根芩連湯聯合柳氮磺吡啶腸溶片治療潰瘍性結腸炎患者48例，結果顯示治療組患者療效（95.8%）明顯高于單純使用柳氮磺吡啶組（83.3%）。賀佳蓓等［3］分別使用葛根芩連湯和奧沙拉秦治療潰瘍性結腸炎患者共66例，結果表明治療組（葛根芩連湯組）在有效率和復發率方面均優于對照組（奧沙拉秦組）。越來越多的臨床結果證實葛根芩連湯的良好療效。

葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎使用廣泛，臨床療效確切。但目前關于其作用機制的研究較少，且中藥治療疾病由于其多成分、多靶點、多通路的特點，使得很難通過單純的實驗研究證明其作用機制，這給中醫藥進一步發展帶來阻礙。本文使用系統網絡藥理學方法，通過搜索多個數據庫，研究潰瘍性結腸炎主要成分葛根、黃芩、黃連、甘草的作用機制，構建葛根芩連湯和潰瘍性結腸炎之間的復雜網絡，嘗試從網絡藥理學角度探討葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎的作用機制。

1 資料與方法

1.1 葛根芩連湯有效成分及作用靶點篩選將葛根、黃芩、黃連、甘草輸入中藥系統藥理學數據庫和分析 平 臺［4］（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），得到每一味中藥的成分。通過將篩選條件設定為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%［5］、類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18［6］，進一步篩選有效成分。將得到的有效成分錄入Excel文件。繼續按照此條件篩選中藥有效成分所對應的蛋白靶點，將所得結果錄入Excel文件中。在UNIPROT數據庫中下載注釋文件，匹配靶點蛋白所對應的基因名稱，得到葛根芩連湯的靶點基因。

1.2 潰瘍性結腸炎疾病靶點基因篩選使用人類基因數據庫（Genecards）檢索潰瘍性結腸炎的基因靶點。Genecards數據庫是一個大型的、多元化的整合數據庫，提供目前所有已經證實的人類基因的信息。以“ulcerative colitis”為關鍵詞進行檢索，將檢索結果保存為Excel表格文件。

1.3 構建蛋白-蛋白相互作用網絡將葛根芩連湯的靶點和潰瘍性結腸炎的靶點進行整合，并去除重復基因和未經證實的基因，得到中藥治療潰瘍性結腸炎的潛在作用靶點。將所得結果輸入STRING數據庫［7］，物種選擇“homo sapiens”，得到葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎的靶點蛋白相互作用網絡。將所得結果保存為tsv格式文件，使用R語言分析核心靶點，與其他靶點連接次數最多者即為核心靶點。

1.4 構建成分-靶點網絡圖將葛根芩連湯“成分-靶點”文件及“中藥-成分”文件分別導入Cytoscape軟件，構建“成分-靶點”網絡圖及“中藥-成分”網絡圖。

1.5 功能分析使用R語言（3.6.3）中的Cluster-Profiler包［8］進行GO富集分析及KEGG通路分析，并使用EnrichPlot包進行結果可視化。

基因本體論（gene ontology，GO）是對基因在不同維度和不同層次上的描述。對基因的描述一般包括3個層面，即細胞成分（cellular component，CC）、生物學過程（biological process，BP）和分子功能（molecular function，MF）。GO分析和KEGG分析基于超幾何分布檢驗。通過GO富集分析和KEGG分析可得到在某些層面具有顯著富集的基因，有助于解釋基因的功能。

2 結果

2.1 葛根芩連湯有效成分及靶點葛根共篩選出有效成分4個，黃芩共篩選出有效成分36個，黃連共篩選出有效成分14個，甘草有效成分7個，其中β-谷甾醇為葛根和黃芩共有成分，小檗堿和黃連堿為黃芩和黃連共有成分，槲皮素為黃連和甘草共有成分，共得到57個有效成分。每味中藥對應有效成分的詳細信息見表1。進一步篩選每個有效成分對應的靶點蛋白，最終葛根共篩選到68個靶點蛋白，黃芩340個靶點蛋白，黃連223個靶點蛋白，甘草178個靶點蛋白。通過與UNIPROT注釋文件匹配，并去除重復后，共得到葛根芩連湯靶點基因194個。

表1 葛根芩連湯有效成分

2.2 潰瘍性結腸炎靶點以“ulcerative colitis”為關鍵詞搜索GnenCards數據庫，共搜索到4 359個靶點基因。去掉相關性低的靶點及未經驗證的靶點，以relevence＜4為標準，最終共篩選得到1 273個靶點基因。

2.3 蛋白-蛋白相互作用網絡將葛根芩連湯的194個靶點與潰瘍性結腸炎的1 273個靶點進行匹配，最終共得到112個共有靶點，結果如圖1所示。

圖1 疾病靶點和中藥靶點韋恩圖

將112個靶點導入STRING數據庫，得到疾病蛋白-蛋白互作網絡。如圖2所示。圖2中每一個小球表示一個靶點，球中的結構為該蛋白的3D結構。不同顏色的連線表示不同的作用信息來源。紫色表示實驗驗證，紅色表示基因融合，藍色表示基因共發生，黑色為共表達。從圖2中可以發現，不同蛋白之間作用十分復雜，這也在一定程度上說明疾病發生的復雜性及中藥治療的多靶點性。

圖2 蛋白-蛋白相互作用網絡圖

使用R語言（3.6.3）分析核心靶點，結果如圖3所示，顯示前30個核心靶點。結果表明AKT1以90次的連接次數位于本網絡的首位，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）、白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、禽肉瘤病毒17轉化基因（v-Jun Avian Sarcoma Virus 17 Oncogene Homolog，JUN）、胱天蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）等依次在后，其余核心靶點詳見圖3。

圖3 核心靶點條形圖

2.4 成分-靶點網絡圖構建成分-靶點網絡文件，共有37個有效成分和112個靶點。將文件導入Cytoscap軟件，得到網絡圖，如圖4所示。圖中綠色方塊表示成分，橙色圓形表示靶點。葛根有效成分中芒柄花黃素對應28個靶點，其余成分對應靶點較少。黃芩中漢黃芩素對應靶點最多，共有38個，其次是黃芩素，共有29個靶點，并且這2個成分都可作用于關鍵靶點AKT1（Protein Kinase B，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶），次黃芩素還可作用于IL-6、JUN、CASP3等關鍵基因，表明其多靶點的治療作用，且影響關鍵基因，作用重大。黃芩素也可作用于AKT1、VEGFA、PTSG1等關鍵基因，也具有強大的調節作用，其余靶點β-谷甾醇、豆甾醇等也具有較多靶點。黃連共檢索到有效成分14個，其中槲皮素找到最多靶點，共有123個，這其中包括CASP3、IL-6、JUN、MYC、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 1，PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）等關鍵基因。

圖4 成分-靶點網絡圖

2.5 功能分析

2.5.1 GO富集分析生物過程（Biological progress）共得到1 909個富集結果，主要包括對脂多糖的反應、對氧化應激的反應、對活性自由氧的反應、對凋亡通路的調節、對轉錄因子活性的影響、對炎癥反應的調節、對細胞分化的反應等。

細胞成分（cellar component）共得到43個富集結果，主要包括轉錄因子復合體、蛋白激酶復合體、細胞核、NAPDH復合體、細胞膜等。

分子功能（molecur function）共得到123個富集結果，主要包括細胞因子活動、受體配體活動、激酶調節、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體超家族、生長因子受體等。

每個GO富集條目取前10條結果以氣泡圖展示，圓圈的大小表示基因富集的數量，同樣顏色由紅變藍表示P值逐漸增大，見圖5。

圖5 GO富集點圖

對于生物過程（BP）的富集結果，將P值由小到大前30個詞條的基因富集結果，以點陣圖的形式展現（按縱軸從原點起P值由小到大排列），可以直觀看出每個生物過程中富集的具體基因，有助于進一步探索發現基因間的相互聯系。詳見圖6。橫軸表示基因，縱軸表示BP條目，若基因在BP條目中，則用黑色實心方框表示。

圖6 生物過程富集點陣圖

2.5.2 KEGG通路分析使用clusterprofiler包進行KEGG通路分析，共富集到150條通路。這些通路大多與炎癥相關，例如Inflammatory bowel disease、IL-17信號通路、TNFα信號通路、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路等，還有部分通路與腫瘤密切相關，如VEGF信號通路、PD1檢查點、P53信號通路等。KEGG通路富集結果展示如圖7。圖8展示了葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎的靶點在Inflammatory bowel disease通路中的表達情況。結果表明，葛根芩連湯可通過調節NFκB信號通路、T細胞受體信號通路、JAK-STAT信號通路等，發揮對潰瘍性結腸炎的治療作用。

圖7 KEGG通路富集結果圖

圖8 Inflammatory bowel disease通路圖

3 討論

潰瘍性結腸炎作為一種自身免疫性的慢性腸道炎癥，尋找高效、安全的治療方法是臨床醫師的首要任務。潰瘍性結腸炎傳統治療方法包括5-氨基水楊酸類藥物、類固醇激素類等，但都存在療效不滿意、易復發等問題。中醫藥治療潰瘍性結腸炎歷史悠久，中醫古籍中雖沒有“潰瘍性結腸炎”這一病名，但古代醫家治療“泄瀉”“腸風”“下利”等多有心得，為后人留下寶貴的財富。葛根芩連湯為仲景名方，被廣泛用于治療腹瀉相關疾病，臨床用于治療潰瘍性結腸炎取得良好療效。葛根芩連湯方中葛根辛甘、涼，可入脾胃經，既能解表，又可調理脾胃，清熱止痢，黃芩、黃連苦寒燥濕，黃芩用于上中二焦，黃連用于中下二焦，二者相互配合，增加利濕之功效，甘草和中，制約三藥之苦寒。全方共奏清熱利濕，解表止痢之功效。

本文通過檢索TCMSP數據庫，共得到葛根芩連湯有效靶點194個，與潰瘍性結腸炎靶點匹配后，共得到葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎靶點112個。AKT1作為本次研究中與其他基因聯系最為緊密的基因，已被證實在潰瘍性結腸炎患者的腸黏膜中表達明顯增高［9］，且在結直腸癌的診斷和預后中具有重要意義［10］。VEGFA也被證實可在多種腫瘤中發揮調節作用［11-13］，并可影響細胞自噬等過程［14］，對炎癥也有一定影響。IL-6、IL-10、IL-1B等白細胞介素家族成員廣泛出現于炎癥調節、細胞自噬、細胞凋亡等研究中，對于各種自身免疫性疾病及腫瘤性疾病都有重要意義。環氧合酶是負責前列腺素合成的限速酶，在某些組織中諸如內皮、腎臟、大腦和腫瘤細胞等中表達，與細胞黏附增加，表型改變，對細胞凋亡的抗性和腫瘤血管生成有關。

GO富集分析結果較多，且主要集中在生物過程條目中。涉及對炎癥反應的調節、對氧化應激的反應、對脂多糖的反應、對活性自由氧的反應、氧化供能、細胞膜通透性、多種激酶調節、轉錄因子調節等。且每個靶點可在不同條目中發揮作用，多個條目之間也可發生相互作用，表明葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎的復雜作用機制，尚需更好的實驗方法解決這種多途徑同時作用的情況。

KEGG通路分析表明，葛根芩連湯可廣泛影響多種經典信號通路發揮對潰瘍性結腸炎的治療作用，例如IL-17信號通路、TNF-α信號通路、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、T細胞受體信號通路、JAK-STAT信號通路等。這些信號通路已有大量實驗證實，在此不做贅述。另外，葛根芩連湯還可作用于p53、colorectal cancer等通路，表明其對腫瘤具有一定的調節作用，值得進一步研究。在富集到的Inflammatory bowel disease通路中，有多種經典信號通路共同發揮調節作用，如NF-κB信號通路、JAK-STAT信號通路，以及白細胞介素超家族、T細胞、抗原提呈細胞等。不同作用環節具體發揮的功能也不同，既有促進也有抑制，還存在目前未確定的機制，需進一步研究。且潰瘍性結腸炎和克羅恩病在發病機制中存在多種重合，在治療時也有許多類似的方法，這在一定程度上給研究者和臨床醫生減輕了負擔。

本文利用系統藥理學方法探索了治瀉名方葛根芩連湯的可能作用靶點及作用機制，結果表明，葛根芩連湯可通過多種靶點、多種生物學過程及通路，對潰瘍性結腸炎的發生發展產生作用。從大數據角度說明葛根芩連湯對潰瘍性結腸炎治療的有效性，同時也為進一步研究潰瘍性結腸炎提供新的思路，期待中藥在治療此類疾病方面取得更大的進步。