基于Wilson病模型論肝主疏泄對銅穩態晝夜節律調控的現代研究構想*

王共強，汪世靖，馬心鋒，韓詠竹，楊任民

安徽中醫藥大學神經病學研究所 安徽合肥 230061

肝主疏泄與銅穩態失調

肝主疏泄理論是在古代醫家不斷總結既有學說并結合臨床實踐反復驗證，最終抽象概括的基礎上才得以確立的。肝主疏泄在晝夜節律調控下的人體衛氣和血液的運行和分布也有著晝夜節律的變化[1]。松果體通過分泌褪黑素調節相關神經-內分泌-免疫網絡，從而完成了肝應五時而變功能的內在調節機制。其調控與神經內分泌系統有關，并有各種神經遞質、激素的參與，有其生理學基礎，肝主疏泄應五時而變是多網絡多層次的復雜聯系[2-3]，但其具體微觀相關物質基礎包括金屬離子穩態等尚需進一步研究。

銅穩態失調涉及多種疾病，包括癌癥、糖尿病、神經系統退行性疾病（阿爾茨海默氏病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）等）及Wilson病（Wilson's disease，WD）等。線粒體及三磷酸腺苷（ATP）也受到生物鐘的控制，細胞需要通過線粒體融合的互補作用來抵抗衰老。Cu轉運蛋白ATPase的表達表現出明顯的晝夜節律性[4]。若是線粒體之間分裂-融合的動態平衡受到干擾，可能會導致健康問題，而介導線粒體分裂及融合的關鍵基因DRP1的磷酸化在線粒體生物節律調控中其中關鍵作用[5]。線粒體銅負荷的不斷增加可能嚴重影響這些細胞器，如同Wilson病（Wilson’s disease，WD）一樣，肝銅超載會導致肝細胞線粒體破壞，肝細胞死亡引起肝衰竭，尤其是在WD和動物模型肝臟中，線粒體逐漸受損的生化功能是肝臟細胞死亡的關鍵因素[6]。因此，有必要揭示銅穩態失調導致細胞最初是如何試圖抵消這種銅超載引發的線粒體衰變的，它們為什么最終失敗以及晝夜節律在其間的調控作用。

WD作為銅穩態失衡相關疾病研究最佳模型之一，是一種常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病，在以D-青霉胺、曲恩汀等為代表的銅螯合藥物治療WD臨床提高了療效，但仍有超過20%患者出現癥狀加重，同時還要預防過度螯合引發銅缺乏等毒副作用。為此，有學者提出WD治療策略的變革，不再提倡驅銅療法以去除堆積的銅，而是使血液中的游離銅離子濃度常態化以逆轉銅中毒[7]。近年來學者不斷嘗試探索非螯合治療方法以減少目前螯合治療的毒副作用，比如生物聚合物8-羥基喹啉、α-硫辛酸、甲烷菌素等在動物實驗取得初步療效，近期有學者提出抗氧化劑褪黑激素可以充當銅螯合劑的研究假設[8]。因此，如何盡快恢復WD患者銅穩態平衡以及篩選最佳銅螯合治療條件是目前急需解決的科學問題。隨著精準醫療理論的展開，如何精確了解銅代謝的途徑及銅穩態維持的機制，研究將為以WD代表的銅穩態失調相關疾病嘗試建立更有效、安全、經濟“精準驅銅”的螯合治療時效模式[9]，對幫助其病情恢復和提高生活質量具有重要的臨床意義。

WD為肝失疏泄之病機理論的探索

祖國醫學文獻中尚未見WD有明確的記載，依據本病多見的腹痛、黃疸、腹水、言語不清、手抖、流涎、肢體扭轉、情緒障礙、精神行為異常等多種臨床癥狀及體征，可將該病歸于“強直”“顫振”“癲狂”“黃疸”“積聚”等范疇。歷來醫家多認為本病病因是由于先天稟賦不足，臟腑氣血功能失調所致。楊任民等[10]根據大多數WD患者所表現出目黃、口中發苦、晨起口氣、尿黃、便秘、舌紅苔黃膩、脈弦數或弦滑等證候，推斷本病主要病因病機為銅毒內蘊而導致日久肝膽濕熱，聚而不散為病。作者團隊前期從絡病理論出發認為WD病機在于毒損絡脈，其演變過程有毒邪伏絡期、毒損肝絡期、肝絡瘀阻期、毒邪逆傳期四個時期。邪毒屬于內生伏毒，“銅毒”只是發病的始動之毒，除“銅毒”之外還有各種級聯內生之毒，提出扶正解毒通絡的基本治療原則[11]。肝主疏泄功能存在季節性的變化，通過自身的季節性變化引起氣血津液以及各項身體機能隨之發生變化，認為這種季節性改變的生理機制是與機體神經內分泌活動密切相關[12]，臨床上軀體外傷及精神刺激等創傷應激常是誘發WD病情發生和加重的主要因素，可見，這與肝失疏泄導致銅毒在體內的重新分布有關[13]。“肝主疏泄”最早來源可追溯到《黃帝內經》，泛指肝臟通過肝氣疏通暢達全身氣機，從而調節全身氣血精津液的運行輸布，又對脾胃的運化、肺氣的升降、腎精的封藏等臟腑功能起到重要的調節作用。肝主疏泄的核心是調暢氣機，中醫學“天人相應”，“五臟應時”，其中肝應春的實質是肝氣疏泄的功能在春季加強，推動氣血津液升發，以適應春 “生”之氣; 在其他季節則是通過肝主疏泄對氣的調控功能隨季節而變化，協同其他四臟共同完成對人體氣機的調節，從而適應自然界生、長、化、收、藏的季節變化。從情志病季節性發病的角度探索肝主疏泄功能發現與之相對應的下丘腦-垂體分泌的褪黑素呈現季節性分泌的變化趨勢，由此體現肝主疏泄四季變化的趨勢[14]。而晝夜與四季也存在相似的變化，根據中醫“子午流注”理論，子午流注即人體氣血于十二時辰間在經脈中流動的盛衰現象，因此，肝主疏泄調控下人體衛氣營血的運動和分布也有著晝夜節律的變化[15]。

線粒體銅穩態與晝夜節律

銅作為一種重要的微量元素，在細胞內作為細胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase CcO）和銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn superoxide dismutase SOD1）合成的輔助因子參與氧化還原反應，而線粒體作為細胞氧化還原反應的重要細胞器，是細胞內存儲、利用銅的主要場所，而線粒體需要維持氧化還原的穩定，必須要有維持一個恒定的銅穩態，而當機體銅穩態出現異常時，細胞內過量蓄積的銅也會有線粒體來處理，此時，線粒體內銅穩態被破壞，進而引起線粒體氧化應激的增強，活性氧的大量產生，最終導致細胞死亡。目前研究認為，參與線粒體銅轉運的相關蛋白主要有：銅伴侶蛋白細胞色素氧化酶（COX）17、19、23，他們均是含有半胱氨酸殘基的可溶性小蛋白，它們與Cu（I）結合，參與CcO和SOD的裝配；或通過谷胱甘肽（glutathione，GSH）和陰離子非蛋白銅配體（anionic non-protein copper ligand，GuL）進入線粒體，而后兩者的具體轉運方式目前尚不明確[5]。而WD作為銅代謝障礙引發銅穩態失調疾病，過量銅蓄積導致肝腦損傷是其重要的病理基礎，而銅過量導致細胞氧化應激損是其重要的病理機制。目前，有關銅離子晝夜節律變化的研究尚不明確，銅離子在細胞內外穩態的調節可能是通過銅轉運蛋白Ctr1和ATP7A蛋白的晝夜表達來實驗，但此想象僅在植物體內發現，尚未見動物細胞的發現[16]，其中復雜的調控機制尚有待進一步研究證實。

近年來，時間生物學是研究熱點，下丘腦視上交叉核（SCN）是調節機體晝夜節律的中樞部位，光照及環境變化均是刺激其生物活動的重要外界因素，通過復雜的環狀調控機制調節機體適應外界環境的變化，這與中醫學“天人合一”的整體觀念一致[17]。目前發現了與晝夜節律相關的基因有CLOCK、Bmal1、Per1/2/3、Cry1/2等，其中Clock/Bmal1是重要的上游基因，可以啟動下游基因Pers、Crys的表達產生正反饋的晝夜節律，而負反饋機制相對復雜，除下游Pers/Crys基因的激活外，機體的代謝、氧化應激反應等均可參與[18]。研究發現，亮氨酸拉鏈家族的核轉錄因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2 relatedfactor 2，Nrf2）作為一種轉錄因子，是細胞發生氧化應激反應的關鍵因子及中樞調節者，正常情況下Nrf2是以無活性的形式與Keap1結合復合物，當細胞氧化應激增強時，細胞內重要的能量調節感受器磷酸腺苷蛋白活化激酶（AMPK）被激活，后者可加速Nrf2與Keapl解離，促使Nrf2發生核轉位進入細胞核，與抗氧化反應元件（antioxidant response elements，ARE）結合，轉錄抗氧化和細胞保護的基因，發揮抗氧化保護作用[19]。當而當機體處于晝夜節律失衡出現氧化應激增強時，節律基因Bmal1可以上調Nrf2的表達，進而產生抗氧化作用，而后者可通過激活線粒體沉默信息調節因子3（Sirt3）的表達，促進線粒體mDNA的表達，激活超氧化物歧化酶（SOD2），減少GSPx的產生，發揮抗氧化作用，同時，Nrf2又能夠上調Per2和Cry2的表達，發生晝夜節律的負反饋調節作用[20]。除外受晝夜節律中樞的調控之外，機體其他臟器亦具有自身獨立的晝夜調節機制，如高通量轉錄組學和代謝組學研究表明，肝臟具有獨特的晝夜節律調節功能，對代謝過程如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）補救途徑和糖原轉換具有特異性。研究證明在其他組織生物鐘功能喪失的情況下，肝臟晝夜節律的自律性也可以維持一定的功能，并可以獨立于中樞生物鐘而對光照改變做出應答，監測晝夜光強度的變化而行使組織功能[21]。生物體銅轉運蛋白表達存在晝夜節律變化，受到細胞代謝、氧化應激等多種因素的影響，從節律基因表達環路的中實現銅轉運蛋白表達的調控，而Nrf2作為重要的核轉錄因子，在銅蓄積導致的氧化應激損傷中發揮保護作用，激活下游Sirt3發揮線粒體保護作用，同時阻斷上游的AMPK磷酸化以及參與節律基因Per2和Cry2表達的調控。因此，明確線粒體銅的轉運通路晝夜節律變化及其機制，對于引導螯合治療以及尋找最佳螯合時效具有重要意義。

展 望

肝的疏泄功能與生命活動息息相關，參與人體氣血運行、水谷運化、水液代謝、精神情志活動等。WD主要病機為先天稟賦不足，后天運化失常，銅毒內聚傷及臟腑，并根據患者主要表現從肝膽濕熱、經脈瘀阻入手，創立以清熱解毒、通腑利濕為治法治則的方劑肝豆湯，使患者臨床改善率明顯提高[22]。中西醫觀的不同對時間生物學的研究提供了新的研究思路，同時時間生物學也為研究中西醫結合提供了廣闊的前景。通過梳理肝主疏泄的晝夜節律，探究WD其生理病理機制。同時也將為AD、PD等其他銅穩態失調相關疾病尋找新的治療思路和借鑒，并結合臨床研究，尋求新的組方思路，對臨床具有重要的指導意義。因此，從現代醫學細胞分子生物學層面，結合時間醫學相關研究結果與肝主疏泄功能和銅穩態平衡結合進行交叉研究，以闡述肝主疏泄對線粒體銅穩態晝夜節律調控的科學內涵，對揭示肝主疏泄從多層次、多因素統一認識機體整體調節規律的深層內涵具有重要意義。