豬圓環病毒2型感染及復制影響因素

方滿新

(宜春學院 生命科學與資源環境學院，江西 宜春 336000)

豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是一種流行于世界各地并嚴重影響養豬業的DNA病毒。目前已知3種PCV基因型，包括PCV1、PCV2和PCV3。PCV1于1974年首次被發現，為豬腎細胞PK-15的非細胞病變污染物，對豬無致病性；PCV3是一種與豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、生殖衰竭和全身炎癥有關的新型圓環病毒，近年在美國、意大利、中國和波蘭等多個國家被報道；PCV2是一種無包膜、單鏈、封閉的環狀DNA病毒，屬于圓環病毒科圓環病毒屬，含有1 767或1 768個核苷酸，最早被發現于20世紀90年代，與豬的一系列綜合征即豬圓環病毒相關疾病(porcine circovirus associated disease，PCVAD)有關，對養豬業造成了重大經濟損失。雖然PCV2感染發病的機制研究已經取得很大進展，但仍有許多重要的問題尚未解決；預防和控制PCVAD的常見措施包括改進管理、控制合并感染、疫苗接種等，但迄今臨床上缺乏有效的抗病毒治療措施來控制PCV2感染。越來越多的研究表明，多種不同的宿主因素、外源因素及病毒自身因素影響PCV2感染與復制，本研究在總結分析各種研究的基礎上，對近年PCV2感染復制過程中各類影響因素最新研究進展進行綜述，為今后的相關研究提供參考。

1 PCV2結構特征及其感染與復制

PCV2擁有一個單鏈和封閉的環狀DNA基因組，雖然PCV2基因組中有11個開放閱讀框，但只有4個蛋白在感染過程中起重要作用。ORF1和ORF2是PCV基因組中最大的2個基因，分別編碼復制酶(Rep)和衣殼蛋白(Cap)。Rep和Cap基因方向相反，在ORF1和ORF2的2個閱讀框之間有1個基因間區作為病毒復制起點(origin of replication,Ori)啟動病毒DNA復制，其特征是包含1個莖環結構。ORF3和ORF4編碼非結構蛋白，ORF5最近被發現，其在PCV2感染后發病機制中的作用還未明確。基于ORF2序列分析，PCV2主要分為5個亞型，即PCV2a、 PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e，近年國內報道了一種新的與其他5種基因型具有較低序列同源性的PCV2基因型，并將其命名為PCV2f[1]。

PCV2病毒感染可分為附著、進入、脫包衣、基因組復制和表達、組裝和釋放等幾個階段。病毒吸附并穿透細胞膜，在胞漿中脫殼后病毒基因組進入細胞核進行轉錄、剪接、翻譯，通過自我組裝形成病毒樣顆粒并進入衣殼，隨后病毒顆粒穿透細胞核與細胞膜并最終釋放。PCV2基因組通過滾環(RCR)機制進行復制，同時由于PCV2基因組較小(1.7 kb)，編碼能力有限，其復制很大程度上依賴于宿主細胞因子。

2 PCV2感染復制中涉及的宿主因素

PCV2在感染后其復制嚴格依賴宿主細胞生理過程，宿主因子受到廣泛調控，通過對PCV2復制機制相關研究分析，發現參與PCV2感染復制的宿主因子包括不同的宿主蛋白、MicroRNAs(miRNAs)等多種宿主因子。

2.1 促進病毒復制的宿主因素自噬是細胞維持穩態的一種重要機制，通過自噬可清除細胞內錯誤折疊或聚集的蛋白質以及受損老化的細胞器。自噬在某些疾病的發生和發展中起著重要作用。miRNAs作為內源性非編碼RNA可以調節基因表達。大量研究表明自噬和miRNAs在調節病毒與宿主的相互作用過程中起著關鍵作用并影響病毒復制。WANG等[2]研究自噬、miRNA與PCV2感染之間關系并發現在3D4/21細胞中，PCV2感染與自噬呈正相關，PCV2感染誘導的自噬促進PCV2復制。同時對篩選出的4個miRNA進一步研究發現，miR-30a-5p模擬物對PCV2復制有顯著影響，miR-30a-5p過表達以劑量依賴的方式顯著增強PCV2感染和自噬，阻斷miR-30a-5p顯著降低PCV2復制。此外miR-30a-5p靶向并調控14-3-3基因，該基因是自噬調節因子，miR-30a-5p通過直接與14-3-3相互作用促進G2期細胞周期阻滯，從而調節PCV2的復制和自噬。另外通過高通量測序獲得PCV2感染3D4/21細胞的miRNAs 表達譜并探討miRNA-98在PCV2復制中的作用，發現miRNA-98可通過調節免疫相關細胞因子的表達來調控宿主免疫功能，協助PCV2逃逸宿主免疫，促進PCV2在3D4/21細胞中復制[3]。Hsp40/DnaJ家族蛋白在病毒感染過程中起著重要作用。豬DNAJB6(pDNAJB6)是該家族的主要成員，pDNAJB6在PCV2感染后顯著上調，證實其與PCV2衣殼蛋白(Cap)相互作用并在PCV2感染細胞的胞漿和細胞核中共定位。進一步研究顯示pDNAJB6在PCV2感染期間通過與病毒衣殼蛋白相互作用促進自噬的形成，從而促進病毒復制[4]。

另一方面，先天性免疫反應主要包括促炎細胞因子、干擾素和趨化因子的產生，干擾素是宿主天然免疫的重要組成部分。先前研究發現PCV2通過RIG-1和MDA-5信號通路誘導干擾素β(IFN-β)的產生進而促進病毒復制[5]。環鳥腺苷酸合成酶(cGAS)被認為是識別胞漿DNA的最重要受體。HUANG等[6]對PCV2誘導IFN-β產生是否與cGAS有關進行研究發現，PCV2感染可增加cGAS和接頭蛋白干擾素刺激因子(STING)的表達水平，促進環二核苷酸(cGAMP)釋放并誘導STING二聚體易位進入PK-15細胞核，表明PCV2感染可激活cGAS/STING信號通路誘導IFN-β的產生并促進病毒復制。另外白細胞介素(IL-10)作為一種重要的抗炎細胞因子，在PCV2感染過程中表達增加，利用IL-10敲除小鼠模型進一步探討IL-10在PCV2感染中的作用機制，顯示IL-10促進PCV2持續感染，PCV2感染可通過IL-10阻斷T細胞向小鼠肺的轉移，減少促炎細胞因子和PCV2特異性抗體的產生，并通過抑制T細胞浸潤加重組織損傷[7]。

此外，宿主細胞的一些蛋白及酶類被發現參與PCV2感染及復制。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是細胞核中一類主要的非組蛋白性核蛋白，負調控PCV2復制[8]。另一方面，研究發現PCV2感染可誘導HMGB1從細胞核向細胞質轉位，而PCV2感染誘導的活性氧(ROS)升高與核HMGB1胞漿轉位密切相關，丙酮酸乙酯能抑制HMGB1的核質轉位，在丙酮酸乙酯處理PCV2感染細胞后，PCV2誘導的ROS生成降低，核質HMGB1易位受到抑制，PCV2復制也隨之降低，即PCV2通過誘導ROS觸發病毒DNA結合蛋白HMGB1的核質易位，進而促進其復制。研究發現PCV2核衣殼蛋白(capsid)氨基酸序列的Loop CT末端含有嚴格保守的 PXXP 功能性基序，該基序可能與含有Src同源性3結構域(src homology 3 domain,SH3)或Src同源性2結構域(src homology 3 domain,SH2)的酪氨酸激酶相互作用。ZHANG等[9]研究PCV2與酪氨酸激酶關系時發現，感染PCV2 增加Src家族激酶表達，PCV2在PK15細胞中的增殖依賴Src家族激酶，且Src家族激酶與血小板源性生長因子受體(PDGFR)協同作用于 PCV2 增殖。

有研究顯示SYNGR2基因在促進病毒復制中發揮作用[10]，穩定干擾IFITM1表達細胞系的建立，表明干擾IFITM1基因明顯促進PCV2復制[11]；RIG-Ⅰ信號通路促進PCV2在PK-15細胞中復制[12]；豬源轉錄因子AP-2δ(poTFAP2δ)可以特異性地增強Rep基因啟動子活性，而且在PCV2感染過程中促進Rep和Cap基因轉錄、翻譯及增加PCV2病毒滴度[13]等。

2.2 限制病毒復制的宿主因素蛋白激酶C(PKC)是一類使底物蛋白分子內絲氨酸/蘇氨酸殘基發生磷酸化的蛋白激酶家族，參與多種病毒感染、細胞抗病毒反應。3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)是膽固醇生物合成的限速酶并參與多種病毒感染過程。MA等[14]發現PKC和HMGCR參與PCV2感染的不同階段，HMGCR在感染的早期發揮抑制PCV2感染作用，而PKC在感染后期促進PCV2感染，此外PKC通過激活JNK1/2，調節這兩種蛋白的磷酸化使HMGCR失活來增強PCV2復制，而HMGCR則可以抑制JNK1/2的磷酸化。研究發現HMGCR與PCV2感染在體內外呈負相關。TING等[15]進一步研究5′-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)和蛋白磷酸酶2(PP2A)參與HMGCR介導的PCV2感染抑制以及豬HMGCR與PCV2蛋白的互作情況，發現細胞內AMPK活性在PCV2感染早期有波動，PP2A對PCV2感染和HMGCR活性影響不大，此外PCV2感染可通過直接與PK-15細胞中的蛋白互作來增強或維持HMGCR磷酸化水平。

另一方面，PCV2基因組ORF5編碼一種非結構蛋白，先前研究表明ORF5蛋白抑制細胞增殖并與宿主跨膜糖蛋白NMB(GPNMB)相互作用。GUO等[16]對GPNMB是否影響PCV2的復制及其分子機制進行研究，首先對PCV2感染和轉染ORF5的豬肺泡巨噬細胞3D4/2(PAM)的轉錄組圖譜進行分析發現，PAMs中GPNMB基因表達下調并證明PCV2 ORF蛋白與GPNMB相互作用，此外發現細胞GPNMB顯著抑制PCV2復制和ORF5表達[17]。PCV2衣殼蛋白(Cap)是一種獨特的結構蛋白，在病毒復制和致病過程中起著關鍵作用，豬源MKRN1(pMKRN1)被發現與PCV2 Cap相互作用，PCV2下調pMKRN1以避免pMKRN1誘導Cap蛋白泛素化和降解，從而促進病毒在其靶組織中的復制。

其他研究包括波形蛋白參與PCV2復制并對PCV2復制有一定的限制作用[18]；ssc-miR-122可抑制PCV2的蛋白表達和病毒DNA復制，并通過與PK15細胞的3′非翻譯區(3′UTR)結合而下調活化T細胞5核因子(NFAT5)和氨肽酶嘌呤霉素敏感區(NPEPPS)的表達[19]；核小體組裝蛋白 1-like-4(NAP1L4)通過IFN-β信號途徑抑制PCV2復制[20]；過表達豬SERPINC1基因能顯著抑制豬肺泡巨噬細胞(PAM)中PCV2的復制[21]等。

這些研究從病毒利用宿主因子的角度闡釋了 PCV2 利用宿主蛋白促進自身增殖的分子機制，為深入了解PCV2感染的發病機制以及PCV2感染過程中與宿主因子之間的相互作用提供新的見解，為PCV2感染的抗病毒治療提供新的靶點及策略。

3 影響PCV2復制的外源性因素

3.1 促進病毒復制的外源性因素谷氨酰胺(glutamine，Gln)是體細胞內外豐富的游離氨基酸，在蛋白質和能量代謝中起著核心作用。先前研究表明Gln缺乏促進體外PCV2感染。LIU等[22]進一步證實Gln缺乏在體內外均促進PCV2感染，同時還誘導自噬，抑制自噬可消除Gln缺乏對PCV2感染的影響；另一方面，ROS的產生可以誘導自噬，抑制ROS的產生，減輕因Gln缺乏而激活的JAK2/STAT3信號通路，從而抑制自噬誘導。這些結果表明Gln缺乏通過上調ROS介導的JAK2/STAT3信號通路激活自噬，從而促進PCV2感染，研究結果也強調補充Gln是有效的策略之一。

赭曲霉毒素A(OTA)是由曲霉屬和青霉屬等產毒真菌產生的一種真菌毒素。先前研究發現小劑量OTA促進PCV2在體外和體內復制，對于其機制進一步研究證實OTA誘導的自噬在體內外促進PCV2復制[23]；在此基礎上，ZHAI等[24]探討氨基酸衍生物牛磺酸對OTA促進PCV2復制的影響及作用機制，結果表明牛磺酸能抑制OTA對PCV2復制的促進作用，通過降低ROS水平和阻斷OTA促進的自噬作用而實現，牛磺酸通過調節ROS/AMPK/mTOR信號軸來抑制自噬，從而抑制OTA促進的PCV2復制，這些發現為使用牛磺酸干預PCV2感染提供了理論依據。

另外研究證實氧化應激可促進PCV2復制，氧化應激誘導PCV2感染的PK15細胞自噬，用抑制劑或特異性siRNA阻斷自噬可顯著抑制氧化應激促進的PCV2復制，更重要的是自噬抑制顯著增加了氧化應激處理的PK15細胞凋亡，是一種基于基因的自主細胞死亡程序，在自噬抑制條件下抑制細胞凋亡恢復PCV2復制，研究揭示氧化應激誘導的自噬通過抑制細胞凋亡途徑促進PCV2在PK15細胞中的復制，從而導致病毒持續感染，研究結果為自噬與凋亡的互作及其在氧化應激促進PCV2復制中的作用提供了一個新的見解[25]；此外低濃度的非離子表面活性劑可以改變細胞膜的物理性質，從而增加藥物的滲透性。HUA等[26]探討了不同的非離子表面活性劑Tween-20、Tween-28、Tween-40、Tween-80、Brij-30、Brij-35、NP-40和TritonX-100對PK-15細胞PCV2感染的影響，并顯示Tween-20能短暫改變PK-15細胞的表面形態，促進PCV2感染，研究結果可用于開發PCV2疫苗。

3.2 抑制病毒復制的外源性因素LIU等[27]證明Hsp90是PCV2感染宿主細胞所必需的，體外抑制Hsp90可以顯著減少病毒復制。進一步對Hsp90抑制劑17-二甲胺乙胺基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-DMAG)在BALB/c小鼠中PCV2感染和免疫應答影響進行研究，表明17-DMAG對BALB/c小鼠體內PCV2復制具有很高的抑制作用，作為一種抗PCV2感染的抗病毒藥物具有潛在的應用價值[28]。進一步探討Hsp90抑制劑17-烯丙氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素(17-AAG)對PCV2復制的調節作用及其機制，發現17-AAG可以抑制PCV2感染誘導的NF-κB活化和Hsp90相關蛋白表達，在病毒吸附后用17-AAG處理PK-15和3D4/31細胞，PCV2復制減弱，17-AAG的存在也降低了PCV2感染細胞中Hsp90相關蛋白表達，這些結果突出了細胞蛋白在PCV2感染過程中的重要性，針對宿主因子的Hsp90抑制劑，例如17-AAG或改進的更有效的衍生物，可以提供一種新的抗病毒策略[29]。

一氧化氮(nitricoxide，NO)是一種重要的具有生物學功能的信號分子，參與多種抗病毒反應過程。由S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)產生的NO在對PK-15細胞和BALB/c小鼠PCV2感染的抗病毒活性研究中，發現NO生成化合物GSNO抑制PK-15細胞PCV2感染，表明NO及其供體GSNO作為抗PCV2感染的抗病毒藥物具有潛在的應用價值[30]；XUE等[31-32]研究發現PCV2復制被一種形式的NO:NO·抑制，而PCV2對另一種形式的NO:NO+不敏感，NO體外抑制PCV2增殖主要是通過NO·實現，表明NO·形式對抗PCV2感染具有潛在作用。

此外，有機硒的主要成分硒蛋氨酸(SeMet)對赭曲霉毒素A(OTA)誘導PCV2復制的作用及其機制研究表明，OTA可以促進PCV2復制并激活自噬，下調p-AKT和p-mTOR的表達。另一方面，SeMet對OTA誘導的PCV2復制具有明顯的抑制作用，同時SeMet能減輕OTA誘導的細胞凋亡自噬和上調OTA誘導的p-AKT和p-mTOR表達抑制，即SeMet通過激活AKT/mTOR通路，抑制OTA誘導的PCV2復制，因此補充SeMet可能是預防PCV2感染的有效策略[33]，自噬可能是開發新型抗PCV2藥物的潛在標志。先前研究表明氧化應激可以促進PCV2復制，而黃芪多糖(APS)/硒可以抑制PCV2復制。LIU等[34]對硒化黃芪多糖(sAPS)對氧化應激誘導的PCV2復制是否有保護作用進行研究，發現H2O2通過3-甲基腺嘌呤(3-MA)和自噬相關基因5(ATG5)的敲除誘導自噬促進PCV2復制，sAPS通過激活PI3K/AKT抑制自噬，進而對氧化應激誘導的對PCV2復制的促進作用進行抑制。

其他一些研究包括牛蒡苷元對PCV2在人工感染仔豬體內的增殖具有明顯的抑制效果，并能減輕由PCV2感染引起的病理變化[35]；伊維菌素作為新型的廣譜、高效、低毒抗生素類抗寄生蟲藥，能抑制PCV2體外復制，減輕病毒感染對仔豬的影響[36]。

有證據表明，大多數現有疫苗未能有效降低豬群中感染PCV2豬的死亡率，對PCV2發病機制的認識不足是獲得特異性抗病毒藥物的主要障礙，這些發現增加了對PCV2發病機制的認識，并為PCVAD的可能控制方法進行了有效摸索。

4 影響PCV2復制的病毒自身因素

PCV有2個主要開放閱讀框ORF1和ORF2。ORF1編碼一種復制相關蛋白Rep，對病毒DNA的復制至關重要。有研究顯示，Rep蛋白存在一些氨基酸缺失，并確定纈氨酸是重要的氨基酸，其導致PCV1在PK-15細胞中的復制效率高于在PCV2中，這些發現有助于探索豬病毒復制機制，并對PCV2疫苗的研制具有重要意義[37]。此前研究發現YiY-3-2-3菌株在ORF1區域有一個自然發生的點突變(G710到A710)，這導致Rep基因產物縮短(945～660 bp)，而Rep蛋白參與PCV2基因組復制。HU等[38]探討這種突變對PCV2復制的影響，發現C端截短的Rep蛋白會降低病毒復制和感染性，表明PCV2的ORF1在進化過程中也可能存在有利和不利的突變。

另一方面，ORF5蛋白是PCV2中新發現的一種非結構蛋白，通過利用RNA測序研究PCV2 ORF5在感染PCV2的豬上皮細胞中作用，發現PCV2 ORF5可以通過轉錄抑制參與Ⅰ型干擾素(IFN)產生的基因來抑制Ⅰ型IFN表達，從而增強PCV2在豬上皮細胞中的復制[39]。進一步研究PCV2 ORF5蛋白對自噬和病毒復制的影響，發現ORF5在PCV2誘導的自噬中起重要作用，PCV2 ORF5誘導自噬以促進病毒在PK-15細胞中的復制，ORF5蛋白可觸發PERK和eIF2a磷酸化和下游轉錄因子ATF4表達。此外ORF5蛋白激活AMPK-ERK1/2-mTOR信號通路，提示ORF5在PCV2誘導自噬中起重要作用，進一步揭示PCV2 ORF5通過PERK-eIF2a-ATF4和AMPK-ERK1/2-mTOR通路促進PCV2復制[40]。

此外，李佳暖等[41]以分離的1株PCV2d流行毒株PCV2RC160307為模板，通過融合PCR突變其Rep蛋白上的1個N-糖基化位點，成功構建自身環化感染性克隆HT-PCV2，轉染ST細胞顯示拯救成功的HT-PCV2病毒滴度，較分離的流行毒株RC160307及未糖基化位點突變的感染性克隆H-PCV2的病毒滴度有所提高，為PCV2復制機制的進一步研究及疫苗的研制奠定基礎。

5 結語及展望

PCV2作為引發PCV相關疾病的病原，對世界養豬業造成了嚴重威脅。因此，進行 PCV2復制及感染致病機制的深入研究，對PCV2防制至關重要。病毒與宿主的相互作用是一個漫長的過程并不斷地進化，在這一過程中，一方面宿主限制因子要抑制病毒；但同時，為了更有效的復制，病毒也會通過不同的機制拮抗宿主限制因子并逃逸其抑制作用。深入研究病毒與宿主間的相互作用，不但會豐富宿主抗病毒限制因子抑制病毒的認識，同時也可以更好地了解病毒本身，了解病毒所編碼蛋白的功能。研究者通過對不同因素包括宿主因素、外源性因素以及病毒自身因素等研究，發現多種因素不僅能夠抑制PCV2復制，還能調節促進病毒的復制。相信隨著分子生物學、免疫學、基因工程技術的不斷發展以及PCV2致病機制的深入研究，對這些影響因素更加透徹的了解將為PCV2的治療及預防提供一些新的思路，找到治療靶點來防治該病毒，進而達到凈化目的。因此，對影響PCV2感染與復制的各類因素的研究具有重大意義，本研究綜述的一些因素在抗病毒領域已經取得了階段性進展，但如何在實際生產中運用有待進一步研究闡明。