肝損傷引起視網(wǎng)膜及血-視網(wǎng)膜屏障的結構功能變化及可能機制研究進展

于絲雨，劉李，劉曉東（中國藥科大學藥學院，南京 211100）

視網(wǎng)膜是人眼內最重要的結構之一。視網(wǎng)膜內部結構及血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的存在利于視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)的維持。視網(wǎng)膜電位圖（electroretinogram，ERG）是臨床上常用的檢查視網(wǎng)膜功能的診斷工具，肝損傷患者ERG 表明其振蕩電位、a 波和b 波均有不同程度的降低和延遲，其改變程度與肝性腦病程度和肝纖維化程度成正相關，說明肝損傷狀態(tài)下視網(wǎng)膜功能出現(xiàn)異常。動物實驗顯示硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）誘導肝損傷和膽管結扎（bile duct ligation，BDL）誘導肝損傷均可引起視網(wǎng)膜病變，提示肝損傷狀態(tài)下視網(wǎng)膜結構和功能發(fā)生變化，但在不同形式的肝損傷狀態(tài)下，肝性視網(wǎng)膜病變的致病機制均有所不同[1]。本文綜述視網(wǎng)膜及BRB 的組織結構與功能，重點綜述幾種不同形式的肝損傷狀態(tài)下視網(wǎng)膜及BRB 結構功能變化及可能機制。

1 視網(wǎng)膜與血-視網(wǎng)膜屏障

1.1 視網(wǎng)膜組織結構

組織學上，可將視網(wǎng)膜大體分為兩層，即視網(wǎng)膜色素上皮層（retinal pigment epithelium，RPE）和視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層（可細分為外限膜、外核層、外叢狀層、內核層、內叢狀層、神經(jīng)節(jié)細胞層、神經(jīng)纖維層及內限膜）；其中RPE、內限膜、外限膜及Müller 細胞在某些物質由玻璃體向視網(wǎng)膜轉運過程中起直接屏障作用[1]。Müller細胞是脊椎動物視網(wǎng)膜中的主要神經(jīng)膠質細胞，其參與構成BRB，對維持視網(wǎng)膜正常結構和功能有重要作用[2]。

1.2 血-視網(wǎng)膜屏障組織結構

血眼屏障由兩大主要部分構成，即前血-房水屏障和后血-視網(wǎng)膜屏障[3]。BRB 主要由視網(wǎng)膜毛細血管內皮細胞及其連接構成內屏障，星形膠質細胞及Müller 細胞的突起包繞其外，參與構成內屏障；由色素上皮細胞及其連接構成外屏障。

BRB 上有多種轉運蛋白表達。轉運蛋白可分為兩大家族，即溶質載體（solute carrier，SLC）超家族和ATP 結合盒（ATP-binding cassette，ABC）超家族。在人的BRB 上表達的SLC 超家族轉運體包括谷氨酸轉運體、神經(jīng)遞質類轉運體、一元羧酸類轉運體、核苷轉運體等，ABC 超家族轉運體包括多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistance-associated proteins，MRPs）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）及乳腺癌耐藥蛋白等[4-6]。

1.3 血-視網(wǎng)膜屏障的功能

BRB 構成的結構性屏障可限制親水性物質由血液至神經(jīng)視網(wǎng)膜側的非特異性轉運。Occludin、ZO-1 是其中代表性的緊密連接蛋白，它們參與構成細胞旁屏障，具有調節(jié)物質轉運的功能，常作為評價緊密連接屏障功能及屏障通透性的指標[7-8]。

BRB 也具有一定的通透性。構成BRB 的視網(wǎng)膜內皮細胞和RPE 細胞上表達有多種特殊轉運體，可將某些重要的營養(yǎng)物質高效地由循環(huán)血液轉運至視網(wǎng)膜側，同時將某些內源性、外源性物質選擇性地外排至視網(wǎng)膜外[6]。BRB 上也表達有其他氨基酸類轉運體[9]，具有轉運左旋多巴[10]、谷氨酸[11]等物質的功能，其他攝取轉運體如一元羧酸轉運體、核苷轉運蛋白也對某些底物在BRB 的轉運過程具有重要作用[5]。

1.4 影響血-視網(wǎng)膜屏障功能的因素

BRB 功能受多種因素影響，缺血、缺氧、滲透壓改變、某些內源性物質及化學物質均會影響屏障結構和功能[12]，特別是BRB 上轉運體的功能與表達水平變化可直接對視網(wǎng)膜屏障功能產生影響。

1.4.1 BRB 上轉運體對視網(wǎng)膜屏障功能的影響除具有轉運營養(yǎng)物質和內源性廢物的功能，BRB上也有多種具有不同生理功能的轉運體和通道表達。多項研究表明P-gp 具有主動外排功能[5，13]，且在人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系及人原代RPE 細胞中有外排轉運蛋白MRP 存在[14-15]。另一類是攝取轉運體，如人RPE 細胞上表達有Na＋-依賴的谷氨酸轉運體家族[16]、Na＋-Cl－依賴的神經(jīng)遞質類轉運體[5]、氨基酸轉運載體[17]；在轉基因大鼠視網(wǎng)膜毛細血管內皮細胞上表達有對半胱氨酸的攝取具有飽和性且受底物氨基酸抑制的谷氨酸/半胱氨酸交換轉運體[18]等。

1.4.2 氧化應激對視網(wǎng)膜屏障功能的影響 氧化應激變化可通過多種機制影響細胞進程。早期用過氧化氫處理BRB 所得的研究結果包括肌動蛋白的重組、細胞間連接蛋白的再分布、RPE 屏障通透性的增加等[19-22]。

1.4.3 某些細胞因子對視網(wǎng)膜屏障功能的影響在糖尿病性視網(wǎng)膜疾病狀態(tài)下，其代謝功能異常通常會導致某些細胞因子如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、白介素的生成異常增多，進而導致血管系統(tǒng)內白細胞增多，發(fā)生血管堵塞、周細胞和內皮細胞的丟失，使血管通透性增加，從而引發(fā)黃斑水腫[23-25]。特別是由VEGF 激活蛋白激酶C 引起Occludin 磷酸化水平變化，進而導致Occludin 蛋白遷移，而后期因Occludin 磷酸化導致的Occludin 蛋白含量降低會使視網(wǎng)膜屏障功能受到進一步的損傷[26]。

2 肝損傷對視網(wǎng)膜屏障功能的影響及可能機制

研究發(fā)現(xiàn)，某些死于肝損傷（包括肝性腦病）的患者其視網(wǎng)膜Müller 細胞發(fā)生了形態(tài)學變化，這種變化與肝性腦病患者腦內膠質細胞（阿爾茨海默-Ⅱ型星形膠質細胞）形態(tài)學變化相似[1，27]，因此將肝損傷狀態(tài)下的視網(wǎng)膜病變定義為肝性視網(wǎng)膜疾病。實驗對11 名患肝硬化（由不同種肝疾病發(fā)展而來）并伴有肝性腦病的患者分別進行眼部常規(guī)檢查、色彩辨認測試及標準視網(wǎng)膜電位測定。實驗結果總結如下[1]：

① 病情嚴重患者暗適應、明適應條件下a 波及b 波均表現(xiàn)為振幅顯著下降，潛伏期延長，且患者振蕩電位的振幅顯著縮小，潛伏期顯著延長[1，28]。a 波反映感光細胞電位水平，b 波主要反映雙極細胞對視覺沖動的傳導情況及Müller 細胞電位水平，振蕩電位主要反映無長突細胞電位水平[29]。

② 病情嚴重患者出現(xiàn)藍-黃顏色識別障礙、視敏度降低、黃斑反射異常甚至消失、RPE 層細顆粒狀改變現(xiàn)象[1]。

因此，為研究此種由肝損傷引起的視網(wǎng)膜結構和功能障礙及可能機制，以下將介紹兩種常用肝損傷模型及一種外源性誘導視網(wǎng)膜病變狀態(tài)下，視網(wǎng)膜及BRB 結構和功能變化的可能機制。

2.1 硫代乙酰胺誘導的肝損傷狀態(tài)下視網(wǎng)膜屏障功能變化及可能機制

首先以大鼠為研究物種，研究TAA 誘導的肝損傷大鼠視網(wǎng)膜免疫形態(tài)學及超微結構變化。光學顯微鏡下，肝損傷大鼠視網(wǎng)膜Müller 細胞細胞質腫脹。在免疫組織學水平上，通過對肝損傷大鼠視網(wǎng)膜Müller 細胞膠質特異性標記蛋白進行免疫染色，同對照組相比，在光學顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜Müller 細胞末梢和玻璃體干細胞突起處表現(xiàn)為視網(wǎng)膜膠質纖維酸性蛋白陽性，肝損傷大鼠視網(wǎng)膜Müller 細胞內谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）免疫反應性明顯增強，具有GS 標記的細胞末梢范圍增大[27]。在超微結構上，肝損傷大鼠視網(wǎng)膜Müller 細胞突起空泡化，特別是細胞末梢含有許多腫脹的線粒體[30]。此外，分別給予亞毒性至毒性劑量的NH4＋，體外培養(yǎng)的正常Müller 細胞也表現(xiàn)出與上述相近的一系列免疫組織學和超微結構變化[31]。對于TAA 誘導的肝損傷引起視網(wǎng)膜Müller 細胞免疫形態(tài)學及超微結構變化的機制已有諸多研究[27-32]：

① 研究發(fā)現(xiàn)對于培養(yǎng)的家兔Müller 細胞，給予氨水平（NH4＋）的劑量升高會伴有視網(wǎng)膜GS 免疫反應性的增強，這與從TAA 誘導的肝損傷大鼠上獲得的結果一致。小鼠視網(wǎng)膜星形膠質細胞若暴露于興奮性氨基酸（包括谷氨酸）下，會刺激GS 活性。而GS 活性的增強可能與谷氨酰胺合成增多密切相關。

② 在大鼠視網(wǎng)膜內釋放谷氨酸的細胞數(shù)量減少，感光細胞變性的情況下，Müller 細胞會下調GS 表達水平。

③ 腦內膠質細胞腫脹是急性肝性腦病特征之一，且在暴露于高濃度氨的Müller 細胞和TAA 誘導的肝損傷小鼠Müller 細胞上均可觀察到細胞腫脹，其可能與黃斑反射的消失有關[31-32]。

④ Müller 細胞是視網(wǎng)膜內唯一具有將谷氨酸轉化為谷氨酰胺功能的細胞，在急性氨升高條件下，大鼠星形膠質細胞內谷氨酰胺濃度升高，且大鼠星形細胞谷氨酸凈攝取量及最大攝取速度提高。其中Müller 細胞內谷氨酰胺濃度升高與滲透性水內流及細胞腫脹密切相關。

因此，由以上諸多研究可以推斷TAA 誘導的肝損傷大鼠眼部發(fā)生變化的原因：TAA 誘導的肝損傷大鼠血清氨濃度升高，Müller 細胞暴露于高濃度氨供應條件下時，其可能通過某種底物調節(jié)機制上調GS 的表達或活性，促進氨和谷氨酸轉化為谷氨酰胺（這可能是Müller 細胞內谷氨酰胺合成增多的原因），進而導致細胞形態(tài)學發(fā)生變化，發(fā)生細胞腫脹和細胞突起空泡化。

另有研究發(fā)現(xiàn)，Müller 細胞損傷可能會通過影響視色素代謝使感光細胞應答和a 波振幅減弱[33]。Müller 細胞內存在細胞視網(wǎng)膜連接蛋白和視黃醇連接蛋白，因此推測在正常視網(wǎng)膜內，Müller 細胞參與視色素的合成與再生循環(huán)[33]，當Müller 細胞受損時，此過程將受到影響。另外由于視網(wǎng)膜活動神經(jīng)元的能量代謝依賴于Müller 細胞與神經(jīng)元的共生，因此Müller 細胞功能障礙會導致神經(jīng)元代謝繼發(fā)性障礙和神經(jīng)信息處理中斷[1]，最終引起視網(wǎng)膜功能障礙。

2.2 膽管結扎誘導的肝硬化狀態(tài)下視網(wǎng)膜屏障功能變化及可能機制

研究發(fā)現(xiàn)BDL 組小鼠出現(xiàn)膽汁淤積現(xiàn)象，與假手術組和對照組小鼠相比，BDL 組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層厚度顯著增加，視網(wǎng)膜形態(tài)發(fā)生變化，其他視網(wǎng)膜層（外核層、外叢狀層、內核層、內叢狀層）厚度無明顯變化[34]。相比于BDL 組，BDL 誘導的肝硬化小鼠給予納曲酮（naltrexone，NTX）后小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞厚度顯著降低，且與假手術組和對照組相比無顯著性差異。另有實驗表明假手術組日常給予NTX注射不會引起小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層厚度增加[34]。由此可以推斷內源性阿片類物質的生成增多可能與BDL 小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層厚度過度增加有關。早期研究表明視網(wǎng)膜上表達有多種特定類型的阿片類受體，另有研究發(fā)現(xiàn)阿片類物質可影響神經(jīng)節(jié)細胞層的活性，且內源性阿片類物質具有調節(jié)處于生長狀態(tài)大鼠視網(wǎng)膜內細胞增殖的作用[35]。

以上研究結果表明，小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學變化可能由BDL 誘導的肝硬化小鼠影響正常的阿片類物質代謝，進而阿片類物質激活視網(wǎng)膜上特定的某種或某幾種阿片類受體，使視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞過度增殖，最終導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層厚度增加。另有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變狀態(tài)下，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層厚度也顯著增加[36]。目前還未有研究表明神經(jīng)節(jié)細胞層厚度的增加對視網(wǎng)膜及BRB 功能是否有直接影響，推測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層厚度增加可能會使視網(wǎng)膜厚度增加，影響視網(wǎng)膜及BRB 的多種功能。

2.3 肝炎病毒誘導的視網(wǎng)膜屏障功能障礙及可能機制

一項臨床研究結果顯示，在患有丙型病毒性肝炎的患者群組內視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病率顯著高于對照組[37]，因此丙型病毒性肝炎與視網(wǎng)膜疾病發(fā)生之間的關系有待研究。

研究表明，鼠肝炎病毒以玻璃體內接種途徑感染白變種實驗室小鼠會引發(fā)急性或慢性的眼部病變。在感染第一階段（1～7 d）可觀察到視網(wǎng)膜血管炎癥產生，并伴有病毒蛋白和侵染性病毒的存在；第二階段（10～140 d）視網(wǎng)膜內病毒蛋白和侵染性病毒消失，動物血清內發(fā)現(xiàn)存在抗病毒中和抗體，視網(wǎng)膜血管炎癥消失，視網(wǎng)膜退行性改變，包括感光細胞層減少、感光細胞間連接蛋白丟失、RPE 異常、視網(wǎng)膜脫落等，進而導致視網(wǎng)膜屏障功能受損。這種退行性變化可能與抗視網(wǎng)膜和抗RPE 細胞自身抗體的生成有關。且在第一階段及第二階段，神經(jīng)視網(wǎng)膜（神經(jīng)節(jié)細胞層、Müller 細胞內等）及RPE 層均存在病毒RNA。研究發(fā)現(xiàn)在動物肝組織中也檢測到相似的病毒類型，表明病毒誘導的視網(wǎng)膜病變與系統(tǒng)性持久性病毒感染密切相關[38]。

RPE 細胞不僅具有調節(jié)視網(wǎng)膜生理結構穩(wěn)定的作用，且具有重要免疫作用。RPE 細胞可生成主要組織相容性復合體，其可呈遞外源性病毒蛋白及視網(wǎng)膜蛋白給輔助T 細胞，從而誘導免疫反應的發(fā)生；視網(wǎng)膜內病毒RNA 的持續(xù)存在可啟動自身免疫反應，進而造成免疫性損傷[38]。因此，在肝炎病毒誘導的視網(wǎng)膜病變狀態(tài)下，病毒RNA 及低水平病毒蛋白的存在與視網(wǎng)膜內多種病理學過程包括視網(wǎng)膜屏障功能障礙相關聯(lián)。

3 結語

綜上，視網(wǎng)膜的屏障功能受多種因素影響。不同形式的肝損傷可通過引起機體內某些物質水平紊亂而誘發(fā)肝性視網(wǎng)膜病變，但其機制不盡相同。