不同實驗動物模型的建立對miRNA調控脂代謝影響的研究進展

張馨心,李林星,夏廣軍*

1.延邊大學融合學院，吉林延吉 133002；2.延邊大學農學院，吉林延吉 133002；3.圖們市農業農村局，吉林圖們 133100

MicroRNA(miRNA)最早是在1993年于秀麗隱桿線蟲中被發現，屬一類不編碼蛋白質、大小為20～24個堿基、廣泛存在于動植物體內的單鏈小分子RNA。miRNA是一類機體的發育和生理過程的重要的調節因子，參與能量代謝，細胞分化，胰腺β細胞的發育，脂質代謝等過程的機體發育和生理過程的重要調節因子。建造動物體內模型可以有意識地將動物按照研究者的意愿對其已有性狀進行控制或篩選，而針對miRNA對脂代謝的調控上構建的動物模型是一種對已在細胞層面上進行實驗的miRNA所具有調控作用或形成的通路的基礎上加以驗證的有效實驗手段。因此本文主要針對目前在動物模型上miRNA對脂代謝的調控，以及在miRNA調控脂代謝時采取基因編輯技術的應用加以陳述，旨在完善miRNA調控脂代謝通路的研究方法，為從分子水平調控提高畜牧產品質量提供參考依據。

1 miRNA通過靶向關系對脂代謝的調控

miRNA通過與靶mRNA序列的3’-UTR區或編碼區堿基配對結合，令靶mRNA降解或抑制蛋白質的合成，從而調控轉錄后基因的蛋白表達。最早證明miRNA能夠具有調控生物體脂代謝作用是在果蠅中，Xu等人的實驗發現了miR-14的缺失導致了果蠅體內三酰基甘油和二酰基甘油含量的增加。隨后Lin等人的實驗證明了在3T3L1前脂肪細胞成脂分化過程中存在著miR-27基因家族的下調的情況，并觀察到脂肪細胞中存在著miR-27的靶基因。He等人確定了miR-199a/214簇直接靶向PRDM16和過氧化物酶體PGC-1α來抑制褐色脂肪細胞的分化和米色脂肪的發育。得出miR-199a/214簇是棕色和米色脂肪發育和生熱的關鍵負調控因子的結論，因此不難推測出，下調miR-199a/214簇有利于脂肪的沉積以及促進脂代謝的形成。Fang等人的實驗發現了miR-30b/c靶向RIP140的3'非翻譯區，并且過表達的miR-30b/c會降低RIP140的表達。而RIP140作為一種轉錄共調節因子，在缺失RIP140小鼠中存在控制胰島素非依賴性葡萄糖攝取的信號通路,從而揭示了miR-30b/c在棕色脂肪細胞分化過程中顯著上調,存在著促進脂肪組織發育的作用機制。

然而，在miRNA與靶基因的靶向關系中，miRNA對脂代謝的調節并不只存在促進作用，同樣存在著抑制作用。Fang等人通過雙熒光素酶報告實驗驗證了GPAM是miR-223的直接靶標，并根據細胞轉染實驗得出miR-223通過靶向GPAM抑制肌內脂肪細胞分化的實驗結論。CCAAT/增強子結合蛋白α基因（C/EBPα）,對脂肪細胞分化具有重要的調控作用。C/EBPα作為miR-124-3p的靶基因，miR-124-3p可以靶向C/EBPa的3’-UTR抑制SVF脂滴的形成，從而影響綿羊SVFs的成脂分化。又有Chen等人證明了MST1是miR-183的靶點，得出miR-183通過靶向山羊乳腺上皮細胞細胞質中的MST1基因來抑制乳脂代謝的結論。

miRNA并不是單一的對某一種靶基因起調控作用，而可能是多個miRNA可共同調節一個mRNA，同時一種miRNA也可調控多種mRNA。研究發現過表達的miR-24會增加PPAR-γ和SREBP1的表達，促進脂質滴形成和甘油三酸酯積累，得出miR-24過表達會促進3T3-L1的脂肪形成的結論，并證明了miR-24是通過直接抑制MAPK信號通路發揮調節作用的。而在Wang等人的實驗中，肥胖誘導的miR-24通過靶向SR-B1來抑制高密度脂蛋白攝取，類固醇激素合成和脂質代謝。

2 miRNA調控脂代謝在構建動物模型上的應用

2.1 鼠

鼠作為一類繁殖能力強且生殖周期短、能夠相對穩定地標準展示出所研究的生理或病理活動的經濟型實驗動物，在研究基因修飾、基因組改造等方面常被選作為實驗動物模型。

Hanin等人的實驗通過將小鼠miR-132前體克隆到pTRE緊密質粒中而產生的誘導型miR-132轉基因小鼠。驗證了由于miR-132的過表達導致代謝率降低以及脂解作用增強，導致肝臟異位脂肪積聚。Wu等人為研究miR-130a-3p在調節脂肪組織糖/脂代謝中的作用，構建了miR-130a-3p敲除小鼠，同時在體外，將3T3-L1細胞用miR-130a-3p模擬物、抑制物進行處理。實驗結果表明miR-130a敲除降低了體內的葡萄糖耐量和胰島素敏感性，與體外細胞實驗結果保持一致。Luo等人驗證了腺病毒介導的miR-21的過表達降低了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的表達，并抑制了原代小鼠肝細胞中葡萄糖的產生。實驗通過對小鼠尾靜脈注射編碼加擾序列、miR-21或miR-21海綿(Ad-spmiR-21)的腺病毒構建腺病毒介導模型，證明miR-21是肝臟糖異生的關鍵調節因子，對于肝臟糖脂代謝轉化具有一定的參考價值。miR-320分別影響細胞質和細胞核中的不同靶基因，共同導致肝臟脂質超載。隨后，Zhan通過使用rAAV系統構建miR-320轉基因小鼠成功抑制肝臟中的miR-320表達，發現抑制miR-320可降低細胞溶膠中的miR-320水平，增加瘦素受體的翻譯，并減少新生脂肪的生成。

2.2 魚

魚類具有個體小、胚胎發育迅速、產卵周期短、單次產卵量大等特點，因此是作為體內驗證的良好的動物模型。

Hsu等人通過產生表達miR-27b-SP的轉基因斑馬魚，使得miR-27b的表達被整體消除。實驗過程中發現miR-27b的缺失可以誘導斑馬魚幼蟲體內和血管內脂質的積累，從而證明了miR-27b是調節斑馬魚脂肪形成的重要脂肪生成因子。Tao等人通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應和熒光素酶報告分析驗證了miR-205-5p和ACACβ基因之間的相互作用，并通過向魚的尾靜脈注射miR-205-5p拮抗劑，發現沉默miR-205-5p除了刺激ACACβ基因的表達，還可以影響脂肪酸合酶(FAS)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα）基因水平。而FAS、PPARα作為參與脂肪酸代謝的重要調節因子，可以通過對FAS和PPARα基因表達量的分析，研究其在脂代謝通路上的作用，從而影響甘油三酯的合成以及脂肪細胞的分化進程。

2.3 兔

實驗兔是一類草食性的恒溫動物，平均壽命約8年，平均體溫為39.0 ℃，對溫度敏感，因此常被應用于熱原試驗、生殖生理、膽固醇代謝和動脈粥樣硬化癥等研究。

Kang等人通過向患有呼吸窘迫綜合征的新生兔體內注射慢病毒包裝的miR-200a，發現上調miR-200a可以降低肺系數，并通過分別檢測過表達和抑制miR-200a的患有呼吸窘迫綜合征新生兔的β-連環蛋白和白介素-10的基因和蛋白表達水平，證明了miR-200a是通過調節Wnt/β-連環蛋白信號通路調節新生兔呼吸窘迫綜合征。而在Zhang等人的研究中，使用qRT-PCR分析驗證了miR-200a增加了參與脂肪生成轉錄、脂肪酸合成和脂肪酸轉運的脂肪細胞特異性基因的表達，證明了miRNA-200a在促進牦牛脂肪細胞分化中起重要作用，并推測是通過抑制非經典Wnt信號通路發揮作用的。

3 總結和展望

文中針對miRNA調控脂代謝在構建動物模型上的應用僅選取了鼠、魚、兔這三類動物進行闡述，現階段其余動物模型少有使用，并缺乏一定普遍性和適應性，因此未來有望選取更多模式動物進行驗證。除此之外在對于miRNA通路的驗證上，多數實驗是在細胞水平進行驗證，并沒有選取合適的實驗動物進一步驗證其分子功能，是因為實驗成本過高，實驗難度較大，故而多采用小鼠模型進行驗證。在后續的實驗研究中仍需進一步明確，針對性的選用家禽家畜等動物的靶向關系，以期在動物模型中驗證miRNA對靶基因的上調或者下調，從而可以對家禽家畜脂肪沉積的調控進行驗證，有望為畜牧產業改善肉質水平提供參考。

參考文獻：略