A型塞內卡病毒檢測方法研究進展

朱亭帆，錢金涵，王強，金文杰

(揚州大學獸醫學院/江蘇省動物預防醫學重點實驗室/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009)

A型塞內卡病毒(SenecavirusA，SVA)原名Seneca Valley virus(SVV)，是一種無包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于微RNA科(Picornaviridae)塞內卡病毒屬(Senecavirus)[1]。SVA最初被確認為是一種細胞培養污染物[2]，但隨后加拿大和美國研究人員發現其是豬水皰病(IVD)的病原體[1]。Knowles等[3]做了回顧性研究，發現SVA在美國豬群中實際存在已經超過30年。2014年之前，僅有少數關于SVA的報道，但是2015年之后，巴西[4]、中國[5]、越南[6]和泰國[7]等國家都報道了與SVA有關的IVD病例發病率的增加。SVA感染豬的病變以水皰形成和表皮糜爛為特征，發展為冠狀血管帶、口腔和鼻平面的潰瘍，受影響的動物出現發燒和跛行[8]。此外，SVA也與新生仔豬死亡率的增加呈正相關[9]。雖然本病還沒有大規模暴發，但是SVA引發的臨床癥狀與口蹄疫病毒(FMDV)、豬水皰病病毒(SVDV)、豬水皰口炎病毒(VSV)、豬皰疹病毒(VESV)引起的水皰病不易區分，并且它是一種外來疾病，一旦暴發給養殖業帶來的損失是不容小覷的。因此，對SVA快速有效的檢測就顯得尤為重要，本文就SVA的實驗室檢測方法進行綜述。

1 病原鑒定

1.1 SVA的分離與鑒定

從患豬血清、糞便、扁桃體、口腔、水皰液等病料中成功進行病毒的分離培養和鑒定是診斷病毒感染的一般方法。可用于分離SVA的細胞系有很多種，其中包括人胚胎視網膜細胞(PER-C6)[2]、人肺癌細胞(NCI-H1299)[10]、人胚胎腎細胞(HEK293T)[11]、豬睪丸細胞(ST)[12]、幼齡倉鼠腎細胞(BHK-21)和豬腎細胞(PK-15)[13]。SVA感染可引起細胞病變，利用傳統的細胞培養方法分離病毒可以為基于流行病學、血清學和抗病毒敏感性試驗的研究提供基礎。然而，用細胞培養進行病毒分離也有缺點，包括：需要較長的時間來誘導和觀察細胞病變效應(CPE)；需要專業的技術知識；有時疑似被感染的樣本數量過于龐大，對樣本中是否有病毒存在的評估就會耗時耗力，所以通過細胞分離病毒進行SVA臨床快速檢測不是最佳方法。

1.2 原位雜交(ISH)和免疫組化(IHC)

ISH和IHC這2種方法分別用來鑒定組織樣本中的特定病毒核酸和抗原。很多研究已經成功使用這2種技術來進行SVA相關疾病的診斷。ISH是一種在完整染色體內對特異性DNA片段定位技術，將標記的核酸探針與組織細胞中的待檢測核酸特異結合，再用檢測系統檢測標記探針，同時顯示核酸所在的位置。Joshi 等[8]將育肥豬經口鼻途徑接種SVA株SD15-26，觀察與SVA感染相關的臨床癥狀和病變，并通過RT-qPCR和原位雜交(ISH)在第38天收集的組織中發現，所有感染了SVA的動物的扁桃體中都存在SVA RNA。隨后，Resende 等[14]于2017年也開發了一種新的基于RNA的原位雜交技術(ISH-RNA)來檢測感染組織中的SVA RNA。與經典原位雜交技術容易出現假陽性染色相比，新的ISH-RNA技術有較高的特異性，其極大地消除了這一限制，且與qRT-PCR技術的結合將會為豬SVA的診斷提供一種高靈敏度和特異性的方法。IHC是利用抗原抗體的特異性結合反應來檢測和定位組織和細胞中的某些化學物質的技術。Leme 等[15]對巴西不同地理區域的7個養豬場中由于皮膚、腸道和神經系統疾病而死亡的仔豬進行了研究，用針對SVA的單克隆抗體進行的IHC結果顯示大腦脈絡叢、舌頭潰瘍病變上皮、腎臟和膀胱的尿路上皮以及腸表面細胞有免疫反應。但是這種技術必須依賴于單克隆抗體，標記每一種特異性抗體只能檢測一種抗原，敏感性較差，同時反應的信號也較小，特別是對于組織或細胞內微量抗原的檢測。

1.3 病毒基因組檢測

在所有的檢測方法中，目前分子檢測法被更多的用于SVA RNA的檢測。因為這些方法不需要長時間的細胞培養，并且由于這些技術針對的是病毒的核酸，所以也不需要通過盲傳來進行病毒的分離，最重要的是分子分析快速、特異和靈敏。因此，對一些在標準細胞系培養中不會增殖的病毒就可用此種方法進行檢測。分子技術還可以分析出病毒的基因組特征或基因進化規律，這對于在特定時期或地理區域傳播的新的野生型病毒株的識別至關重要。

1.3.1 PCR

PCR技術的廣泛應用及適用性廣使其成為世界各地實驗室的常規方法，近年來研究人員建立了多種PCR法檢測SVA，其中RT-PCR是一種快速確定動物是否急性感染病毒或水皰是否含有病毒的方法。Leme 等[4]設計了1套引物，用于RT-PCR擴增SVA基因組VP3/VP1區542 bp大小的產物。用RT-PCR對臨床上患有水皰病豬的水皰液、拭子、破裂小泡等樣品以及臨床健康動物進行SVA檢測。RT-PCR結果分析顯示，上述所有采集的樣本均擴增出542 bp大小的產物，即全部樣品SVA呈陽性，而臨床健康的豬均未檢出該病毒。序列分析表明，該病毒與SVV-01原型株和其他北美分離的SVA株有很高的核苷酸(87.6%～98.5%)和氨基酸(95%～99.4%)的相似性。試驗表明該引物適用于SVA的分子鑒定，提示SVA是豬群水皰病暴發的病原。但是RT-PCR的陰性結果卻不能用來排除以前接觸過病原的豬群，因為感染的臨床癥狀通常在1～2周內就會消失。

1.3.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

qRT-PCR具有更高的敏感性和特異性，可同時快速檢測大批量樣品。Bracht 等[16]通過擴增SVA VP1基因983 bp大小的片段，建立了一種靈敏的SYBR Green RT-qPCR檢測方法，這種方法能夠直接檢測到不同水皰標本中的低水平SVA RNA，這些水皰標本包括蹄部病變組織、口腔和鼻部上皮、口腔拭子、肝臟、淋巴結。Agnol 等[17]、郭振華等[18]都通過擴增SVA VP1蛋白保守基因組區的片段，研究設計并建立了一種基于TaqMan的敏感而特異的qRT-PCR方法來檢測和定量感染豬組織中的SVA。同樣，張志等[19]以分離到的1株SVA流行病毒株GXT91作為參考毒株，設計合成了TaqMan探針和1對引物，并建立了SVA的熒光RT-PCR方法。樊曉旭等[20]針對病毒 3D基因區域分別設計引物和探針，建立的TaqMan熒光定量PCR最低檢測靈敏度為 2.8 copies/μL，高于普通 PCR，批內、批間變異系數為1.73%～4.00%，具有良好的穩定性。與傳統RT-PCR相比，該方法提供了一個高通量平臺，通過將熒光標記的目標特異性探針與擴增過程相結合，實現了更高的靈敏度和特異性。但是qRT-PCR需要特殊的設備、昂貴的用品和熟練的工作人員，因此，這種技術并不能被廣泛應用。

1.3.3 套式PCR

套式PCR是指利用2套PCR引物(套式引物)進行2輪PCR擴增反應。Feronato等[21]通過擴增SVA基因組中316 bp的VP1片段，建立1套套式PCR 方法。在37頭仔豬中，RT-PCR和套式PCR 檢測SVA的陽性率分別為15頭(40.5%)和23頭(62.2%)。結果表明，與常規RT-PCR相比，套式PCR 具有更高的靈敏度，反應效率更高、操作簡單，是一種經濟有效的診斷方法，特別是在常規RT-PCR中目標感染源的樣本為陰性的情況下，或者是當細胞培養中的病毒分離不可用以及當必須對大量樣本進行病毒檢查時。由于套式PCR 反應有2次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性，增加了檢測的敏感性；又有2對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。該技術被建議用于流行病學研究中的病毒調查以及通過對豬群進行SVA的常規調查來進行健康監測。

1.3.4 環介導等溫擴增(LAMP)技術

LAMP被認為是檢測和鑒定病毒病原體的一種替代方法，特別是在那些實驗室資源有限的地區。LAMP利用6個靶標特異性引物來擴增靶標中的8個區域病毒基因組，整個過程在60～65°C的恒溫范圍內一步完成，密閉管的性能還有助于防止污染，并滿足簡單性要求。楊鈺楚等[22]根據SVA VP1基因序列，設計1套對應目的片段6個區域的4條特異性引物進行核酸擴增，建立RT-LAMP檢測方法，該方法準確、簡便、經濟有效，尤其適用于現場和基層實驗室對SVA的快速診斷。Zeng等[23]根據GenBank中已有的序列比對，選擇針對VP2保守編碼區的引物，建立實時RT-LAMP檢測方法并與實時RT-PCR、常規RT-PCR的方法進行對比。實時RT-PCR和實時RT-LAMP檢測結果證實SVA的患病率較高，分別為64.4%和71.2%，而常規RT-PCR檢測SVA陽性率僅為34.7%，說明實時RT-LAMP和實時RT-PCR方法更優越，為實驗室檢測SVA提供了一種不依賴昂貴設備和儀器的新方法。

1.3.5 數字PCR(RT-ddPCR)

數字PCR(也可稱單分子PCR)是繼實時定量PCR之后新興發展起來的一種絕對定量分析技術。通過將單個DNA分子轉移入獨立的反應室，PCR 擴增反應后，對熒光信號進行檢測分析，實現單分子的絕對定量。Pinheiro-de-Oliveira等[24]基于RNA逆轉錄酶微滴數字PCR的診斷工具標準化，采用一步法和兩步法，與RT- PCR、RT-qPCR(一步法和兩步法)同時進行對生物樣品中的SVA病毒核酸進行檢測。結果表明，一步法不管是檢測還是分析的特異性方面都優于兩步法。此外，用單步分析方法對巴西SVA的生物學樣本進行RT-ddPCR和RT-qPCR結果的一致性為94.2%。相較于RT-qPCR定量目標分子時需要高效的標準曲線，RT-ddPCR不需要參考曲線，具有很好的準確度和重現性。所以RT-ddPCR可以作為一種輔助診斷工具為隨后SVA RNA的絕對定量分析打下良好的基礎，同時也可以通過這種方法對豬水皰病進行有效的控制。

2 血清學檢測方法

2.1 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

血清中特異性抗體水平是鑒別病毒感染的有效指標。血清抗體測定在流行病學研究中對動物或人群免疫狀態的確定具有重要意義。有研究表明，抗SVA VP1 蛋白抗體的測定可以作為檢測SVA感染細胞的方法[13]。范慧等[25]以純化的重組VP1蛋白作為包被抗原，建立了SVA VP1間接ELISA抗體檢測方法，且該方法批內和批間重復性試驗的變異系數均小于13%，表明該方法重復性和穩定性均較好。Gimenez-Lirola等[26]通過每周對母豬和仔豬血清樣本進行SVA VP1重組蛋白(rVP1)間接ELISA，評估其對SVA的血清學應答(IgG)。農作榮等[27]通過對SVA的衣殼蛋白VP1進行原核表達，并制備其多克隆抗體，結果表明，該多克隆抗體能跟SVA抗原特異性結合，為豬塞內卡病毒ELISA檢測等其他方法的建立提供了良好的生物材料。Dvorak等[28]、申珊等[29]都曾以SVA的VP2蛋白建立一種間接ELISA方法，以此來鑒定血清中的SVA抗體，用來檢測感染后一段時間內SVA抗體的存在和水平。但是SVA VP1 ELISA這種檢測方法沒有得到全面的驗證，而基于SVA VP2的間接ELISA能快速、可靠地檢測豬體內存在的SVA抗體。申水瑩等[30]通過克隆SVA的VP3基因，將其與pQE-30表達載體連接，并進行原核表達，對表達的蛋白進行純化和鑒定，用純化的重組VP3蛋白(rVP3)作為包被抗原，通過矩陣法優化ELISA反應條件，建立檢測SVA抗體的間接ELISA方法，經檢測評估，該方法具有較好的特異性、敏感性、重復性和穩定性。

競爭性酶聯免疫吸附試驗(cELISA)被廣泛用于血清抗體的檢測。該方法測定了在臨床樣本中存在的具有良好特征的單克隆抗體(mAb)之間的特異性抗原競爭。Yang等[31]在2012年率先使用純化的病毒作為抗原制作出了單克隆抗體，使用點雜交試驗，單克隆抗體的反應性被證實是特異性的。采用滅活的病毒抗原和單抗進行血清診斷，該試驗建立了一種SVA特異性cELISA。與間接ELISA相比，cELISA很容易操作，并且可以進行放大以適應大量血清的篩選。

對于SVA的檢測，OIE參考的cELISA具有0.45%的假陽性率，而在病毒中和試驗(VNT)重新檢測假陽性血清后可以進一步降低到0.1%～0.2%，雖然VNT法可以降低陽性率，但VNT法需要活病毒、細胞培養設施，至少需要3～4 d才能取得結果，這大大增加了控制疾病的成本，延緩了檢測進度。所以Yang等[32]利用重組SVA病毒樣顆粒(VLP)和SVA特異性mAb建立了一種ELISA方法，其與cELISA聯合使用，為一種輔助診斷工具，減少陽性率。

2.2 間接免疫熒光(IFA)檢測SVA

除了ELISA，IFA檢測SVA IgG抗體已被廣泛報道。 Houston等[33]為了確定SVA在美國非臨床感染畜群中的血清效價，采用SVA rVP1 ELISA和SVA IFA檢測SVA血清效價。結果表明這2種方法在畜群水平上表現出一致性，且發現SVA在美國養殖場是亞臨床循環。該方法的優點是當 ELISA 檢測結果不確定或制備抗原困難或復雜時，可選用此法，即SVA rVP1的ELISA法和IFA的聯合使用有助于豬場陽性豬的檢出。

3 小結

2015年，由SVA引起的水皰病在我國廣東省首次報告[34]。此后，黑龍江[10]、吉林[35]、福建[36]、河南[37]、海南[38]等省份都有此病毒的發現，這是一種對養豬業造成嚴重危害的新發傳染病。雖然在中國SVA的暴發只是零星發生，但是其極有可能通過商業活動等傳播到其他無SVA地區。如果不采取預防措施，就可能在不同區域之間快速傳播。而眾多研究人員已經開發出多種 SVA實驗室診斷方法，以便在現場條件下進行早期診斷。對于病原檢測，SVA病原的分離與鑒定、免疫組化和原位雜交、病毒基因組檢測方法(RT-PCR、qRT-PCR、套式PCR、RT-LAMP、RT-ddPCR)在診斷中發揮重要作用，尤其是PCR、實時熒光定量 PCR、LAMP 等分子生物學技術更在豬感染SVA的早期即可檢測到病毒核酸，在SVA的早期檢測中具有重要作用；血清學方面，用免疫學方法檢測抗體可以了解 SVA感染、發生、發展的進程，即有多種ELISA以及IFA的方法用于SVA檢測。總之，SVA的實驗室檢測方法多種多樣，各有優缺點，但是隨著免疫學與分子生物學技術的不斷發展，將開發出更多簡單快速的檢測技術應用于SVA的防控。