微量元素復合劑對嗜酸乳酸菌保存活力的影響

千慧燕，閔鵬飛，楊冰祎，賈立軍*，劉德志

1.延邊大學農學院動物醫學系，吉林延吉 133000；2.吉林省磐石市富太鎮畜牧服務站，吉林磐石132307

乳酸菌(LAB)是一類能夠利用糖類進行代謝的革蘭氏陽性細菌，其生存范圍從土壤、植物覆蓋到哺乳動物的口腔、胃腸道等[1]。經研究證明，乳酸菌的活用對動物健康有密切關系。乳酸菌不僅能夠調節體內腸道正常菌群、保持微生態平衡、控制內毒素、抑制腸道內腐敗菌生長繁殖，同時，乳酸菌通過發酵產生的有機酸、特殊酶系、胞外多糖、細菌素等營養物質，可刺激組織發育，從而對動物的營養狀態、免疫反應等產生促進作用。并且，絕大多數乳酸菌具有抗菌活性，主要是源于其生長代謝過程中所分泌的一系列活性物質，諸如乳酸、胞外多糖、抗菌肽以及細菌素等[2]。所以乳酸菌具有非常良好的抗菌活性，同時也是其益生活力的重要指標之一。正常情況下的乳酸菌，活力極弱，這些益生菌只能在受到一定限制的環境中生存，一旦脫離生存條件，其自身就會遭到滅亡。所以只有經過特殊工藝保護的乳酸菌才能到達腸道。進入體內的乳酸菌，必須具有數量多、活力強，才能充分發揮生物功效。如何研制出高濃度且活力強的乳酸菌，成為了當今微生學家們追求的目標。

微量元素復合劑是經過加工和調節的礦物質，含有大量的微量元素。礦物來自自然界，是自然界中經過長時間的惡劣天氣自然形成的巖石，以不同大小的顆粒形式存在于自然界中。由于乳酸菌的培養條件較好，而且對其生長和繁殖所需的微量元素的研究正在進行中，因此對有機微元素的研究很多，但過程成本較高，關于天然礦物微量元素的研究更少。本試驗中使用了天然礦物質來優化營養條件和影響的觀察來研究起初對乳酸菌的生長和繁殖、酸和堿的變化、細菌代謝物的溫度和抗菌的效果。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

乳酸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均從中科院微生物研究所購置，并在延邊大學農學院微生物與免疫試驗室保存。

1.2 培養基

MRS液體培養基、MRS固體培養基本實驗室配制。

1.3 乳酸菌的培養

將獲得的嗜酸乳桿菌材料與生理鹽水配置成懸濁液，再用劃線法接種到MRS瓊脂平板上，在恒溫培養箱培養，使用接種環從平板培養物上挑取某一單獨菌落，移種至MRS液體試管中，配置5組，再挑出4組加入乳酸菌培養中所需的常量元素，在恒溫培養箱培養。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌原液稀釋至106cfu/mL，倒入平皿中，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。

1.4 微量元素復合劑濃度對乳酸菌活性的影響

以濃度梯度法，將復合劑分別加入到含有常量元素的4組MRS液體試管中。設置復合劑濃度梯度分別為0.05%、0.1%、0.25%、0.5%。不含復合劑和常量元素的MRS液體試管設為空白對照組。先高壓滅菌備用，再取乳酸菌懸液100 μL, 分別接種到MRS液體梯度試管中混勻,置37 ℃條件下厭氧培養48 h。使用平板計數法，采取MRS培養液接種到平板中培養，觀察乳酸菌活性的濃度變化。

1.5 微量元素復合劑濃度對乳酸菌數量的影響

配合使用平板計數法：分別從取嗜酸乳菌MRS培養液樣品中搖勻取樣，在無菌環境下，用平板劃線法接種到普通瓊脂平板培養基中培養24 h，觀察并記錄平板培養基上菌落的數量。

1.6 微量元素復合劑濃度對乳酸菌形態的影響

采取MRS培養液，在潔凈無脂的載玻片上涂直徑1 cm左右的涂膜。使用革蘭氏染色劑依次進行革蘭氏染色，最后用高清晰顯微鏡觀察活菌形態。

1.7 微量元素復合劑對乳酸菌菌液渾濁度變化的影響

取5 mL的菌液置于10 mL離心管中，經4 000 r/min，離心20 min。棄去上清液，用生理鹽水洗滌。洗滌兩次后，用紫外分光光度計在波長600 nm范圍，測定該菌的吸光值，結合記錄的數據分析比較乳酸菌活性變化。

1.8 微量元素復合劑對乳酸菌抑菌效果的影響

取制備大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌層的平皿和離心后的上清液，使用牛津杯法，用抑菌圈用尺測量抑菌圈大小。測試6種乳酸菌的代謝產物針對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌的抑菌效果，分別測抑菌圈直徑，取平均值，分析礦粉對嗜酸乳桿菌代謝產物抑菌效果的影響。

2 結果

2.1 細菌形態學觀察

經高清晰顯微鏡觀察，細菌接種于普通瓊脂培養基上，培養后觀察可見細菌生長良好，菌落呈表面光滑不透明的圓形乳白色白蠟狀菌落，直徑約4～6 mm。

2.2 微量元素復合劑濃度對乳酸菌活性的影響

實驗結果表明，與空白對照組(即0%)對比,微量元素復合劑對乳酸菌的生長有促進作用。每一組加入復合劑的實驗組乳酸菌數量都要比空白組多，并且和空白對照組相比活菌數量幅度穩定，死亡速度非常緩慢，仍然保持活性，當復合劑的濃度達到0.10%時，乳酸菌的增殖菌數最多，細菌最多數量為3.56×108，乳酸菌數量比較空白對照組多了0.8%。由此可見，濃度0.1%的微量元素復合劑最為適宜。

2.3 微量元素復合劑對細菌抑菌作用的影響

在金黃色葡萄球菌的抑菌實驗數據中可知，微量元素復合劑濃度為0.05%和0.1%的抑菌圈直徑與空白對照組的抑菌圈直徑接近，其中濃度0.05%的乳酸菌代謝產物抑菌作用大于空白組。微量元素復合劑濃度0.1%的乳酸菌代謝產物的抑菌作用和空白對照組相似，濃度0.05%的乳酸菌代謝產物的抑菌作用均大于空白對照組。

在大腸肝菌的抑菌實驗數據中可知，第一次乳酸菌抑菌圈直徑中每一組濃度均比空白對照組大，在第二次測量中每一組抑菌圈直徑都在10 mm左右。微量元素復合劑濃度0.05%和0.1%的乳酸菌代謝產物的抑菌圈直徑平均數值比空白對照組大，濃度0.1%的乳酸菌代謝產物的抑菌作用均大于空白對照組。

3 討論

微量元素作為微生物生長所必需，是構成細菌菌體的重要組成成分，主要起到調節微生物生長滲透壓，維持增殖過程中所需酶的活性等作用。在地殼中自然存在的微量礦物質元素，作為生物成長中的營養元素，對身體維持生命起著重要作用。礦物質、微量元素為乳酸菌的生長和繁殖提供了必要的營養。乳酸菌是腸道菌群的主要組成部分，其代謝產物如細菌素可抑制腸道細菌中受損細菌的生長和繁殖，并對維持腸道微生物的平衡起著重要作用。代謝物乳酸細菌培養測試后的24 h內,結果表明,礦物質微量元素可以更好地改善代謝產物乳酸細菌的抗菌食品工業中,能夠抑制有害細菌的生長和繁殖的食品,延長壽命。

本實驗中，通過對實驗結果的分析,適當濃度(即0.1 g/mL)的微量元素可以促進乳酸菌的生長和繁殖,延長其存活時間,并提高乳酸菌的抑菌效果在其他細菌和抑菌作用的持續時間增加。