FM19G11體外增敏替莫唑胺對MGMT陽性惡性膠質瘤細胞系的作用機制

方黃毅，尤朝國，龐 晨，章鐘鼎，張 哲，況統帥，盛漢松

(1.溫州醫科大學 第二臨床醫學院，浙江 溫州 325035；溫州醫科大學附屬第二醫院 2.耳鼻咽喉科； 3.神經外科，浙江 溫州 325027)

惡性膠質瘤(malignant glioma)是一類發病率較高的常見腫瘤，約占所有原發性腦腫瘤的45%，可嚴重影響患者腦組織功能[1]。新型烷化劑——替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是臨床上的一線化療藥物，但在化療過程中出現化療不敏感的現象[2]。研究報道限制TMZ臨床療效的多數原因是膠質瘤細胞內MGMT的活性,MGMT是一種DNA修復酶，能夠逆轉TMZ的療效[3]。研究證實參與MGMT基因轉錄及蛋白翻譯的調控機制主要包括NF-κB、P53和SP1等介導的信號通路[4]。低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)是在低氧細胞的細胞核提取物中發現的一種DNA結合蛋白。在惡性膠質瘤的研究中，少量研究報道了HIF-1α的靶向抑制劑FM19G11可以降低腫瘤細胞中MGMT的表達[5]。上述研究表明FM19G11通過抑制HIF-1α可能能夠克服MGMT介導的TMZ耐藥。本研究選取了前期研究發現的MGMT陽性的人源性惡性膠質瘤細胞系T98G[5]，主要探討FM19G11對TMZ誘導T98G細胞的藥物敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1．1 研究對象：人源性惡性膠質瘤細胞系T98G(中國科學院上海生命科學院研究院生物化學與細胞生物學研究所)。

1.1.2 主要試劑:DMEM培養基、雙抗、胎牛血清、胰蛋白酶(含EDTA)(Gibco公司)；FM19G11(Sigma-Aldrich公司)；一抗(Abcam公司)；二抗(上海碧云天生物技術有限公司)；RT-qPCR引物(上海生工生物技術公司合成)；反轉錄PCR試劑盒、real-time PCR 試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養傳代:將T98G細胞按要求進行復蘇后接種于含10%小牛血清的DMEM培養基(37 ℃、5% CO2培養箱)培養，當細胞增殖至70%～80%匯合時，收集處于對數增殖期的細胞進行傳代，根據細胞的數量以及增殖狀態進行1∶2或者1∶3傳代培養。每次細胞實驗操作前使用錐蟲藍染色法觀察細胞活力，確定細胞活力在98%以上。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活性:將T98G細胞以5×103個/孔的細胞數接種于96孔培養板，每孔100 μL，每組設6個復孔，邊緣孔用PBS液填充。置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱內培養24 h后，對細胞進行換液，分別加入終濃度為0.5 μmol/L FM19G11、200 μmol/L TMZ、0.5 μmol/L FM19G11+200 μmol/L TMZ。分別培養24、48 和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑。避光繼續孵育1～4 h后，然后棄除培養基。使用酶標儀測定各孔于450 nm波長處的吸光度值。

1.2.3 細胞克隆形成實驗觀察細胞增殖:將T98G細胞以每孔500個細胞分別接種含1 mL 10%胎牛血清的DMEM培養液的6孔板中。孵育24 h貼壁后，按“1.2.2”分組加入藥物處理，每3～4 d換液。當肉眼能看到點點的克隆群時，終止培養。棄去上清液，用PBS浸洗2次。加4%多聚甲醛(每孔1 mL)固定15 min。棄除固定液，加1 mL結晶紫染色液染色10～15 min，流水沖洗，干燥后拍照。在低倍鏡下計數大于50個細胞的克隆數。

1.2.4 Hoechst 33258染色法檢測細胞凋亡形態變化:把預先高溫高壓滅菌消毒過的小圓玻片放入24孔板中，將T98G細胞接種于孔內，置于恒溫培養箱中貼壁培養12 h；細胞爬片后，吸去培養液后按“1.2.2”的分組加入藥物處理24 h，按照熒光染色試劑盒說明書逐步進行操作。

1.2.5 RT-qPCR檢測細胞中HIF-1α、EPO和VEGF的mRNA表達:收集0、0.5、1和2 μmol/L FM19G11處理24 h的T98G細胞，采用Trizol法提取各組細胞的總RNA。根據試劑盒說明書制備cDNA，以cDNA為模板配置RT-PCR反應體系。引物設計與合成：HIF-1α的正向引物為5′-GTCTGA GGGGACAGGAGGAT-3′，反向引物為5′-CTCCTCA GGTGGCTTGTCAG-3′；VEGF的正向引物為5′-TA TGTTTGACTGCTGTGGACTTGA-3′，反向引物為5′-CAGGGATGGGTTTGTCGTGT-3′；EPO正向引物為5′-TTACCAGCTCGAAGGTGAATCAAGA-3′，反向引物為5′-GCGTCCAGGAGCACTACTTCATTG-3′；內參GAPDH正向引物為5′-TGGACTCCACGACGTACTC AG-3′，反向引物為5′-CGGGAAGCTTGTCATCAATG GAA-3′。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，循環40次。進行熒光定量PCR擴增后，得到相應的Ct值，計算各組目的基因和內參基因的表達量。使用2-ΔΔCt方法計算相應的目的基因的相對表達量。

1.2.6 Western blot檢測細胞中HIF-1α、EPO、VEGF、MGMT和NF-κB P65蛋白表達水平:收集0、0.5、1和2 μmol/L FM19G11處理24 h的T98G細胞，PBS 洗滌3次, RIPA 裂解液在冰盒上裂解10 min，提取蛋白, 12 000 r/min離心15 min, 吸取上清液備用。BCA法測量總蛋白濃度, 蛋白樣品經SDS-PAGE凝膠電泳約2 h后, 濕法轉膜1.5 h,轉膜完成后5%脫脂牛奶中封閉，封閉完成后洗膜，然后使用HIF-1α、EPO、VEGF、MGMT和NF-κB P65相應一抗4 ℃孵育過夜,孵育完成后洗膜，用二抗的封閉液室溫孵育1 h，洗膜，最后ECL顯色, 照相并分析結果。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 FM19G11聯合TMZ處理抑制T98G細胞增殖

FM19G11單獨處理對T98G細胞并無增殖抑制作用。200 μmol/L TMZ處理T98G細胞有抑制作用，但并非十分敏感。0.5 μmol/L FM19G11和200 μmol/L TMZ聯合對惡性膠質瘤T98G細胞有強烈的抑制作用(P<0.05,n=6)(圖1A)。細胞克隆形成實驗進一步證實這一現象(P<0.05,n=3)(圖1B)。

2.2 惡性膠質瘤T98G細胞經FM19G11、TMZ分別單獨處理及二者聯合處理發生凋亡性形態改變

聯合處理組瘤細胞的凋亡性改變較TMZ單獨處理組更加明顯(圖2)。此外，Hoechst33258細胞核染色從另一方面說明了這一現象(圖2)，聯合處理組的T98G細胞的細胞核折光度明顯增加，部分細胞核出現分葉狀改變，少數細胞核已經發生裂解(凋亡小體)。

2.3 FM19G11抑制T98G細胞內HIF-1α及其下游基因的表達

不同濃度FM19G11處理后T98G細胞內HIF-1α，VEGF和EPO的mRNA(圖3A)和蛋白(圖3B)表達均呈劑量-效應關系，顯著低于對照組(均P<0.05)。

2.4 FM19G11抑制T98G細胞內MGMT和NF-κB信號通路的表達

不同濃度FM19G11處理后T98G細胞內MGMT和NF-κB P65的蛋白表達呈劑量-效應關系，均低于正常對照組(P<0.05)(圖4)。

2.5 FM19G11和TMZ聯合處理對T98G細胞內MGMT和NF-κB信號通路的調控作用

與對照組相比，FM19G11顯著降低了T98G細胞內MGMT的表達(10.4%±3.6%)(P<0.05)，而TMZ上調了T98G細胞內MGMT的表達(24.8%±2.4%)(P<0.05)，FM19G11和TMZ的聯合處理顯著降低MGMT的表達(60.4%±4.3%)(P<0.05)。此外，FM19G11不僅單獨作用能明顯下調NF-κB p65亞基的表達水平(32.3%±3.3%)(P<0.05)，在它與TMZ聯合作用之后，這種下調作用仍然十分顯著(62.7%±3.5%)(P<0.05)(圖5)。

A.CCK-8 assay; B.cell clone formation assay; *P<0.05 compared with T98G group圖1 FM19G11和TMZ對T98G細胞增殖的影響Fig 1 Effects of FM19G11 and TMZ on proliferation of T98G

圖2 FM19G11和TMZ處理對T98G 細胞凋亡的影響Fig 2 Effects of FM19G11 and TMZ on apoptosis of T98G cells(×200)

A.RT-qPCR; B.Western blot; *P<0.05 compared with 0 μmol/L FM19G11 group圖3 FM19G11對T98G細胞中HIF-1α、VEGF和EPO表達的影響Fig 3 Effect of FM19G11 on the expression of HIF-1α, VEGF and EPO in T98G

*P<0.05 compared with 0 μmol/L FM19G11圖4 FM19G11對T98G細胞中MGMT和NF-ΚB P65蛋白表達的影響Fig 4 Effect of FM19G11 on the expression of MGMT and NF-κB P65 proteins in T98G

3 討論

新型烷化劑TMZ是治療惡性膠質瘤的化療藥物之一，但在治療過程中發現部分患者對TMZ并不敏感。TMZ主要通過甲基化DNA中的核苷酸位點,導致不可修復的DNA損傷，從而使細胞周期阻滯和誘導細胞發生凋亡。MGMT是細胞中一種主要修復由各種烷化劑造成的細胞DNA損傷的酶,能夠特定的移除O6-甲基鳥嘌呤上的甲基團從而逆轉TMZ的效果[6]。近期少數研究表明，在惡性膠質瘤細胞、垂體腺瘤細胞等惡性腫瘤中發現抑制HIF-1α可以降低MGMT的表達[7-8]。

HIF-1α是低氧條件下廣泛存在于人體細胞中的一種轉錄因子。研究證實腫瘤中氧濃度較低，HIF-1α在許多腫瘤中大量表達，對腫瘤的生長、血管形成、轉移、 凋亡及耐藥皆有影響[9-10]。少數研究發現抑制HIF-1α可以降低MGMT的表達。通過腫瘤內注射小干擾RNA(siRNA)破壞HIF-1α的作用，導致動物體內移植的人腦膠質瘤體積縮小[11]。 HIF-1α抑制劑2-甲氧基雌二醇(2-ME)在缺氧條件下能夠下調MGMT表達[7]。 但是，2-ME具有較大細胞毒性，限制了進一步的臨床研究。FM19G11是一種新型HIF-1α抑制劑，在較低濃度時能夠起到藥物作用而無細胞毒性[5]。本研究發現在MGMT表達陽性的T98G細胞中，FM19G11通過靶向抑制HIF-1α的表達，進而降低MGMT的表達。此外，HIF-1α下游與腫瘤細胞增殖相關的基因VEGF和EPO表達也受到抑制。相對于TMZ單獨處理，FM19G11和TMZ的聯合處理對T98G細胞具有更加顯著的抑制增殖和誘導凋亡的作用。

*P<0.05 compared with 0 μmol/L FM19G11+0 μmol/L TMZ圖5 FM19G11和TMZ對T98G細胞內HIF-1α、MGMT和NF-κB P65蛋白表達的影響

NF-κB蛋白廣泛存在于機體細胞中, 是一類能與多基因啟動子部位的κB 位點特異結合并促進轉錄的DNA結合蛋白總稱。有研究表明在健康人腦組織細胞中僅存在無活化的NF-κB蛋白表達, 而在膠質瘤細胞中則可以檢測到活化的NF-κB蛋白[12]。在惡性膠質瘤研究的報道中,NF-κB可以誘導MGMT蛋白的表達, 導致細胞株對烷化劑耐藥[13]，本研究發現FM19G11處理T98G細胞后，降低了NF-κB蛋白表達，這說明NF-κB信號通路可能參與FM19G11對MGMT的調節作用。

綜上所述，FM19G11主要通過靶向抑制HIF-1α的表達下調MGMT的表達水平，從而增強惡性膠質瘤細胞系T98G對TMZ的藥物敏感性。此外，NF-κB信號通路也參與FM19G11對MGMT的調控，但是NF-κB信號通路如何參與HIF-1α對MGMT的調控以及它們之間的相互關系并不清楚，值得深入探討。