X線對秀麗隱桿線蟲DNA損傷修復基因表達的影響

陳利娜，劉 志，張 超

(1.南方醫科大學 基礎醫學院 生化與分子生物學教研室，廣東 廣州 510515； 2.南方醫院 超聲科，廣東 廣州 510000；3.湘南學院 基礎醫學院，湖南 郴州 423000)

放射治療(radiotherapy)常用于腫瘤治療，然而電離輻射在殺傷腫瘤細胞時也會損傷正常組織和細胞，提高腫瘤細胞對輻射的敏感性是提高腫瘤細胞殺傷效率和減少健康細胞損傷的關鍵。電離輻射(ionizing radiation)是一種有效的DNA損傷因子，可導致細胞生物損傷[1]。眾多基因和通路可影響腫瘤放療效果，研究與DNA損傷密切相關的基因是尋找放療靶基因的方法之一。

秀麗隱桿線蟲(caenorhabditis elegans，C.elegans)有許多高度保守的與人類癌相關的基因和通路，且對電離輻射表現出較高的敏感性，是一種理想的電離輻射研究模型[2]。本研究采用X線照射秀麗隱桿線蟲，檢測DNA損傷修復相關基因的表達，以及線蟲死亡率、生育力變化，探討輻射損傷修復的分子機制，為尋找放療潛在靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型秀麗隱桿線蟲N2、大腸桿菌OP50(華南農業大學贈予)；NGM培養基、M9緩沖液按照參考文獻[3]配制而成，RNAiso Plus試劑、反轉錄試劑和SYBR?PCR試劑盒(TaKaRa公司)；PCR引物(廣州嘉吉生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 秀麗隱桿線蟲的培養及計數：取50條產卵期秀麗隱桿線蟲接種至培養有大腸桿菌菌株OP50的NGM瓊脂平板，于20 ℃培養箱中培養2～3 h，挑走母蟲后繼續培養24 h。線蟲計數采用稀釋法：M9緩沖液沖洗收集培養皿中線蟲至離心管，稀釋50倍，62 ℃水浴1 min后混勻，取1 mL線蟲懸液至畫好方格的35 mm的培養皿，在體式顯微鏡下放大100倍對線蟲計數，計數重復3次，取平均值,再乘以稀釋倍數即為線蟲總數。

1.2.2 秀麗隱桿線蟲的電離輻射：線蟲計數后將線蟲懸液離心使線蟲沉淀，棄去上清，加入相應體積的M9緩沖液，使得線蟲懸液的濃度為5 000條/200 μL。在含有OP50的NGM培養基中加入5 000條線蟲(200 μL)，培養48 h后成蟲繁殖到約80 000條時進行輻射。使用日立MBR-1520R型X線輻射裝置(Hitachi Co., LTD)調節輻射強度為20 Gy/min，并增加濾片使照射場強均一。輻照時敞口垂直于束流方向放置，置于正對著束流方向的培養基表面分別照射10 min和20 min，累計輻射劑量分別為200 Gy和400 Gy。實驗重復3次。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測基因表達：RNAiso Plus試劑提取線蟲總RNA，反轉錄試劑盒將合格的總RNA反向轉錄成第一鏈cDNA。使用SYBR?PCR試劑盒在ABI公司7500型實時PCR擴增儀上進行實時qPCR。內部參照基因采用gpd-1。用于PCR的基因和引物見表1。2-ΔΔCt值反映基因相對表達量。實驗重復3次。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.4 秀麗隱桿線蟲死亡率和繁殖力的檢測：線蟲經200 Gy X線照射后2 h內取約5 000條線蟲(200 μL)轉移至加有400 μmol/L 5-氟脫氧尿苷(FUDR)的NGM培養基，以抑制卵的孵出。繼續培養2 d后對活線蟲計數。線蟲死亡率計算公式如下：[Δ存活數/存活數(輻射前)]×100。線蟲經200 Gy X線照射后2 h內取約5 000條線蟲(200 μL)轉移至新NGM培養基，培養2 d后對活的子代幼蟲計數，反映線蟲的繁殖力。線蟲計數時，于體式顯微鏡下觀察其形態和運動情況，呈正弦曲線樣運動的線蟲為活線蟲；喪失運動能力, 咽泵停止運動,多次碰觸無反應的線蟲為死亡的線蟲。

1.2.5 輻射相關基因相互作用網絡的分析：將輻射后表達差異基因導入蛋白質相互作用關系數據庫STRING (https://string-db.org/)，并選擇種類為C.elegans，分析各基因編碼蛋白之間的相互作用及關鍵節點蛋白質。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 X線影響秀麗隱桿線蟲多個基因的表達

X線照射后12個基因(ced-3、ced-4、ced-9、egl-1、cep-1、rad-51、age-1、daf-2、daf-16、ctl-1、clk-1和spe-26)表達量增加，2個基因(mev-1、hsp-12.2)表達量減少。多組比較結果顯示，400 Gy組中有8個基因(ced-3、ced-4、ced-9、rad-51、age-1、daf-2、ctl-1、spe-26)的表達明顯高于200 Gy組。實驗組的4個基因(ced-4、cep-1、rad-51、daf-2)表達量明顯高于對照組。200 Gy組基因mRNA表達量的倍數變化如下：ced-4(2.861±0.243)、cep-1(5.540±1.889)、rad-51(5.530±0.647)、daf-2(4.453±0.686)。400 Gy組數據如下：ced-4(9.644±1.022)、cep-1(10.140±1.150)、rad-51(19.017±2.627)、daf-2(8.948±0.907)(圖1)。

2.2 X線導致秀麗隱桿線蟲死亡率增加、繁殖力下降

與對照組相比，200 Gy組的線蟲存活率明顯下降。200 Gy X線導致線蟲77.23%死亡率(圖2A)。對照組培養2 d后平均產生線蟲后代數是200 Gy組的2.90倍(圖2B)。

2.3 秀麗隱桿線蟲輻射相關基因的相互作用

12個基因之間具有相互作用，并顯著分為兩組作用密切的基因群。其中，age-1、daf-16和ced-9分別為兩組基因的中心節點。daf-16和cep-1為兩組基因的關聯基因(圖3)。

3 討論

電離輻射可促進細胞周期阻滯和DNA修復，誘導細胞凋亡。在真核細胞中產生特定生物效應所需的電離輻射劑量與細胞基因組含有基因數的多少成反比，秀麗隱桿線蟲模型用于研究電離輻射特性時所需的劑量遠大于哺乳動物[4]。本研究中X線輻射線蟲的半致死劑量為200 Gy[5]，故輻射劑量定為200 Gy和400 Gy。

Expression levels, relative to gpd-1( a type of housekeeping gene ), were determined by quantitative real time RT-PCR; *P<0.05，**P<0.01 compared with controls

A.mortality； B.fertility；*P<0.05 compared with controls圖2 X線對秀麗隱桿線蟲的影響Fig 2 Effect of X-ray on n=6)

圖3 輻射相關基因的蛋白相互作用圖Fig 3 Protein interaction of radiation related genes

egl-1可使ced-9失活，從而拮抗apaf-1同源基因ced-4激活caspase同源基因ced-3的能力。此外，p53同源基因cep-1可以激活egl-1和ced-13的轉錄。因此，cep1、egl-1、ced-3、ced-4和ced-9等基因的相互作用形成了調控秀麗線蟲程序性細胞死亡和DNA損傷誘導的生殖細胞死亡的核心凋亡通路[6-8]。本研究中，線蟲輻射后存活數減少，凋亡相關基因ced-3、ced-4、cep-1表達量顯著增加，且隨輻射劑量增加而大幅度增加。基因相互作用分析結果顯示，cep-1、ced-4、rad-51關聯密切。提示這3個基因對電離輻射敏感度高，可能是X線誘導細胞凋亡的核心基因。

進化生物學表明，繁殖需要付出降低壽命的成本，線蟲延長壽命基因的改變會導致生育能力下降[9-10]。mev-1突變體使秀麗隱桿線蟲平均壽命縮短30%，age-1、clk-1和spe-26、hsp-12.2的突變體，可改變秀麗隱桿線蟲的年齡特異性死亡率和生育率[11-12]，胰島素信號通路可提高秀麗隱桿線蟲的繁殖力[13]。daf-2是一種類似于胰島素受體的基因，調節秀麗隱桿線蟲的壽命和滯育。daf-16可加強線蟲生殖細胞損傷的適應。daf-2和daf-16都是胰島素信號通路的重要成員，對秀麗隱桿線蟲的繁殖力起關鍵作用[14]。本研究中，經輻射處理后的線蟲成活率較低，經過2 d培養后產生線蟲的后代總數較少，說明200 Gy X線導致秀麗隱桿線蟲的死亡率較高，生育力較低。結合輻射后線蟲基因表達的變化，推測X線致使daf-2和daf-16異常高表達，從而抑制胰島素信號通路，降低線蟲生殖質量，抑制線蟲繁殖。X線可顯著提高線蟲daf-2、age-1、clk-1、spe-26的表達，從而改變線蟲的死亡率和生育能力。

綜上所述，X線可影響秀麗隱桿線蟲多個DNA損傷修復基因的表達，并導致線蟲死亡率增加、繁殖力下降。age-1、cep-1、ced-4、rad-51和daf-2等基因對X線敏感，可能成為潛在的放療靶點。