益氣通絡(luò)方對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠HMGB1表達(dá)的影響

姜立娟 周曉晶 李欣 李玉國 崔巍 張文風(fēng) (長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130000)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病最為常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其起病隱匿，常被忽視〔1〕，臨床表現(xiàn)為四肢遠(yuǎn)端出現(xiàn)對稱性感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)障礙，并伴有麻木、疼痛、灼熱、蟻行感等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致糖尿病足部潰瘍、感染甚至壞死、癱瘓〔2〕。DPN發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，至今仍未有完全清晰的闡釋，主要涉及糖代謝紊亂、脂代謝異常、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、糖基化產(chǎn)物蓄積、蛋白激酶C信號通路異常調(diào)控等諸多方面，治療方向主要為控制血糖和改善疼痛〔3〕。DPN是消渴病之變證，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痹病”“血痹”“絡(luò)病”等范疇，消渴日久，氣陰兩虛，脈絡(luò)瘀阻是其病機(jī)關(guān)鍵，治宜益氣養(yǎng)陰，活血通絡(luò)〔4〕。本文通過建立DPN大鼠模型，觀察益氣通絡(luò)方對大鼠體重、空腹血糖(FBG)、坐骨神經(jīng)中高遷移率族蛋白(HMG)B1蛋白及基因表達(dá)水平的影響，探討其對DPN的治療效果及改善DPN的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 70只雄性健康SPF級SD大鼠，平均體重(180±20)g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物許可證號:SCXK(遼)2015-0001。

1.2主要藥物及試劑 益氣通絡(luò)方由黃芪12 g、葛根12 g、生地10 g、當(dāng)歸10 g、桂枝10 g、地龍5 g組成,購自北京同仁堂紅旗街店，并經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翁麗麗教授鑒定為正品，符合2015年版《中華藥典規(guī)范》。格華止鹽酸二甲雙胍片(購自吉林大藥房博碩路店)。鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司，購自北京博愛港股份有限公司，產(chǎn)品批號20190505)。RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)及HMGB1引物〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)，抗大鼠HMGB1單克隆抗體(Abcam公司)。

1.3儀器與設(shè)備 血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)，臺式低溫高速離心機(jī)(美國Sigma公司)，Medlab生物信號采集處理系統(tǒng) (南京美易科技有限公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BioTek Elx808)，PCR擴(kuò)增儀〔TC-48/T/H(a),美國〕，熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.4模型建立及分組 將60只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，造模前禁食12 h后，按照55 mg/kg左下腹腔注射1%的STZ溶液，注射30 min后正常喂水喂食，72 h后取尾靜脈血檢測FBG，若FBG≥16.7 mmol/L即視為造模成功，并取同批次FBG在正常范圍(4.7～8.3 mmol/L)的大鼠10只作為正常對照組。造模后，將56只造模成功大鼠隨機(jī)分為模型對照組、益氣通絡(luò)方高劑量組、益氣通絡(luò)方低劑量組和西藥對照組，每組14只。造模成功后即按照人與大鼠體表面積換算法計(jì)算給藥劑量進(jìn)行灌胃給藥，益氣通絡(luò)方低、高劑量組分別給予益氣通絡(luò)方1.84 g/(kg·d)、7.36 g/(kg·d)，西藥對照組給予二甲雙胍140 mg/(kg·d)，模型對照組和正常對照組給予等量的0.9% NaCl溶液灌胃，干預(yù)12 w，平時(shí)注意觀察大鼠狀態(tài)，每周定期檢測FBG和體重。電子天平稱取大鼠體質(zhì)量；三諾血糖儀檢測大鼠尾靜脈血糖。

1.5Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)檢測各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度 按照30 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉成功后，取俯臥位固定，用玻璃分針鈍性分離大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)，應(yīng)用Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)對大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度進(jìn)行檢測〔5〕。

1.6免疫組化法檢測各組DPN大鼠坐骨神經(jīng)HMGB1蛋白表達(dá)水平 將固定于4%多聚甲醛溶液中的各組坐骨神經(jīng)標(biāo)本制成石蠟切片并脫蠟至水。微波熱修復(fù)抗原，為保證染色的特異性，將內(nèi)源性過氧化物酶滅活，滴加抗大鼠HMGB1單克隆抗體，37℃，2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替陰性正常組一抗，然后加入辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG多克隆抗體，37℃，30 min，隨后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片，在高倍鏡視野(×400)下每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，應(yīng)用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對神經(jīng)細(xì)胞陽性細(xì)胞積分光密度值(IOD)進(jìn)行測定。

1.7RT-PCR法檢測各組DPN大鼠坐骨神經(jīng)中HMGB1 mRNA表達(dá) 從液氮中取出保存?zhèn)溆玫淖巧窠?jīng)，應(yīng)用RNA提取試劑盒提取總RNA。參照試劑盒操作說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。HMGB1上游序列為5′-GCAGCAGTGTTGTTCCACAT-3′，下游序列為5′-CGGCCTTCTTCTTGTTCTGT-3′，內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游序列為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游序列為5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。以cDNA 1 μl為模板擴(kuò)增HMGB1和GAPDH，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)情況。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1一般情況觀察 干預(yù)12 w后，與正常對照組相比，其他各組表現(xiàn)出不同程度的多飲、多食、尿量增多及體重下降。模型對照組毛色污穢發(fā)黃、缺少光澤，豎毛弓，背腹部膨隆，活動(dòng)度減小，精神萎靡不振，后肢單側(cè)或雙側(cè)偶見痙攣甚至痿廢。各治療組與模型對照組比較病變程度較輕，其中益氣通絡(luò)方高劑量組與西藥對照組狀態(tài)較好。

2.2益氣通絡(luò)方對DPN大鼠體重及FBG的影響 干預(yù)12 w后，模型對照組體重較正常對照組顯著降低，F(xiàn)BG顯著升高(P<0.05)；進(jìn)行藥物干預(yù)后，益氣通絡(luò)方高、低劑量組與模型對照組比較，體重顯著升高，F(xiàn)BG顯著降低(P<0.05)，其中，益氣通絡(luò)方高劑量組體重增長和FBG下降更為顯著(P<0.05)。見表1。

2.3益氣通絡(luò)方對DPN大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響 給藥12 w后，與模型對照組相比，各組坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)及感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SNCV)顯著升高(P<0.05)；益氣通絡(luò)方高劑量組MNCV、SNCV改善顯著(P<0.05)。說明益氣通絡(luò)方可顯著提高DPN大鼠的坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。見表1。

2.4益氣通絡(luò)方對DPN大鼠坐骨神經(jīng)中HMGB1蛋白和mRNA表達(dá)的影響 干預(yù)12 w后，模型對照組HMGB1蛋白和mRNA表達(dá)顯著高于正常對照組(P<0.01)；與模型對照組比較,益氣通絡(luò)方高、低劑量組與西藥對照組坐骨神經(jīng)中的HMGB1蛋白和mRNA表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)。說明益氣通絡(luò)方與西藥效果一致，都能使DPN大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)HMGB1蛋白和mRNA含量表達(dá)降低，但益氣通絡(luò)方高劑量組較低劑量組效果更佳。見表1。

3 討 論

DPN的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡釋清晰。研究發(fā)現(xiàn)〔6〕，低水平慢性炎癥反應(yīng)在DPN發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到人們的關(guān)注。HMGB1作為一種重要的晚期致炎因子，幾乎表達(dá)于所有細(xì)胞中〔7〕，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放，其功能是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)〔8〕。正常情況下，HMGB1存在于細(xì)胞核內(nèi)，負(fù)責(zé)參與轉(zhuǎn)錄和調(diào)控基因〔9〕；當(dāng)機(jī)體缺血、缺氧時(shí)，HMGB1通過主動(dòng)分泌或被動(dòng)釋放兩種方式至胞外，發(fā)揮炎性介質(zhì)的作用〔10〕，指導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子、神經(jīng)免疫或代謝活動(dòng)等〔11〕。且HMGB1通過識別晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)和Toll樣受體(如TLR2、TLR4)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，加速免疫損傷〔12,13〕。此外,HMGB1可調(diào)節(jié)自噬,增強(qiáng)細(xì)胞存活,并限制細(xì)胞凋亡〔14〕。HMGB1信號級聯(lián)還可能觸發(fā)核因子(NF)-κB途徑，進(jìn)一步激發(fā)炎癥反應(yīng)，增加組織損傷。因此，進(jìn)一步探索HMGB1相關(guān)信號通路可能為DPN的治療提供新的靶點(diǎn)。

益氣通絡(luò)方是張文風(fēng)教授多年臨床治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣養(yǎng)陰，活血通絡(luò)的功效，臨床效果顯著。方中芪葛同用為君，益氣養(yǎng)陰，祛瘀通絡(luò)；桂枝辛散溫通，配伍黃芪，益氣溫陽，活血通經(jīng)；生地清熱養(yǎng)陰生津，俱為臣藥。當(dāng)歸補(bǔ)血活血，與生地相配，養(yǎng)血活血，祛瘀不傷陰，此為佐藥。地龍善走力專，通經(jīng)活絡(luò)，并引藥入絡(luò)，為佐使藥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、葛根有效成分都有降血糖、抗炎及保護(hù)神經(jīng)作用〔15〕，黃芪、葛根配伍能夠減輕機(jī)體的糖脂代謝紊亂和炎癥反應(yīng)，且增加機(jī)體對胰島素的敏感性〔16,17〕。生地具有抗炎、改善血糖及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，環(huán)烯醚萜苷是生地的有效成分，對晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)引起的糖尿病血管病變具有明顯的抑制作用〔18〕。研究證實(shí)，當(dāng)歸能對缺氧所致的神經(jīng)損傷進(jìn)行保護(hù)；并促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子激活和神經(jīng)再生〔19〕；桂枝揮發(fā)油具有抑制炎癥反應(yīng)及抗氧化作用，能顯著拮抗免疫損傷性炎癥〔20〕；地龍中蚓激酶可通過改善血液循環(huán)從而減少糖尿病患者周圍神經(jīng)的缺血缺氧性損傷,有效地促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)、再生〔21〕。諸藥合用，可發(fā)揮改善神經(jīng)細(xì)胞功能、營養(yǎng)周圍神經(jīng)作用，有效改善DPN的神經(jīng)損傷。

本研究提示益氣通絡(luò)方可以有效降低DPN大鼠FBG，增加體重，改善坐骨神經(jīng)炎癥損傷；可有效下調(diào)坐骨神經(jīng)HMGB1蛋白和mRNA水平，HMGB1可能參與DPN的發(fā)病過程，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)坐骨神經(jīng)免收損傷，對DPN具有很好的治療效果。