溫肺補氣通絡方對TGF-β1誘導A549細胞增殖及上皮間質轉化的影響

丁露 宋思雨 李雅馨 李香艷 王澤玉

(長春中醫藥大學 1中西醫結合學院，吉林 長春 130117；2吉林省人參科學研究院)

肺纖維化是由多種病因引起的累及肺泡、肺間質、細支氣管的慢性、彌漫性、間質性肺疾病，患者中位生存期平均3～5年，死亡率較高；目前主要以對癥治療為主〔1，2〕。肺泡上皮細胞在轉化生長因子(TGF)-β1誘導下導致細胞過度增殖和上皮間質轉化(EMT)〔3〕，并伴有平滑肌肌動蛋白-α(α-SMA)和Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)過度表達；上述病理過程在肺纖維化形成中起決定性作用〔4，5〕。基于“久病入絡”理論和多年臨床實踐，在經方補陽還五湯基礎上加減化裁為溫肺補氣通絡方(WFBQTL)，多年臨床應用已證實該方具有抗炎、止咳、平喘、化痰的作用〔6〕，但對肺泡上皮細胞增殖及間質化的影響尚不清楚。本研究在TGF-β1誘導的肺腺癌A549細胞模型上，探討WFBQTL對細胞增殖及EMT的作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞 Ⅱ型肺泡上皮細胞來源人非小細胞腺癌A549細胞，來源于中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。

1.2試劑與用藥 WFBQTL組成為黃芪、黃芩、丹參、虎杖、當歸、川芎、地龍、連翹、紫苑、款冬花、姜半夏，購自長春中醫藥大學附屬醫院。胎牛血清(Clark，美國)；RPMI1640培養基(Gibco，美國)；10倍磷酸鹽緩沖液(PBS，碧云天)；胰酶、青鏈霉素雙抗(勃林格殷格翰生物藥業)；TGF-β1(Sigma，美國)；甲基偶氮唑藍(MTT)粉末(索萊寶公司)；抗體E-鈣黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、Collagen Ⅰ、α-SMA、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(Abcam，英國)、TRIzol試劑(Invitrogen，美國)、逆轉錄試劑盒(天根公司)和PCR引物(上海生工)。

1.3實驗儀器 CO2培養箱、酶聯免疫檢測儀(Thermo Fisher Scientific，美國)；蛋白電泳儀、轉膜儀、熒光實時定量PCR儀(Bio-Rad，美國)；可視相差倒置顯微鏡(奧林普斯，日本)、多色熒光、化學發光凝膠成像系統(ProteinSimple，美國)。

1.4溫肺補氣通絡方的制備 將中藥飲片用玻璃器皿按1∶10比例煮沸，每次煎煮0.5 h，共煎3次，合并所有煎出的藥液；過濾、離心取上清，在80℃條件下加熱濃縮，經冷凍干燥機進行凍干處理獲得粉末。使用時，稱取5 mg干粉溶于1 ml PBS溶液，配置成5 mg/ml母液，過濾除菌后置于4℃保存備用。

1.5細胞培養及分組處理 從液氮中取出凍存的A549細胞，于37℃恒溫水浴搖晃溶解至冰水混合狀態，在紫外消毒的超凈臺內，將細胞懸液加入9 ml含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗的RPMI1640完全培養基中；1 000 r/min離心5 min后棄除上清，再用5 ml RPMI1640完全培養基重懸細胞，加入T25培養瓶中于37℃、5%CO2培養箱中培養過夜。次日進行常規換液，觀察細胞生長狀態，細胞生長密度至70%使用胰酶消化傳代培養擴增。將A549細胞鋪于96/6孔板內，用5 ng/ml TGF-β1誘導建立細胞模型，同時給予不同濃度的WFBQTL對其干預，進而觀察細胞增殖和EMT相關標志物變化情況，并拍照記錄細胞形態。對照組：完全培養基，TGF-β1組：5 ng/ml TGF-β1，WFBQTL：5 ng/ml TGF-β1+WFBQTL(62.5、125.0、250.0、500.0 μg/ml)干預24、48或72 h。

1.6MTT法 3組處理后，每孔加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液繼續培養4 h，再加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，震蕩30 s混勻，使用酶標儀在波長490 nm下檢測各孔吸光度(OD)值，計算各組細胞增殖率。

1.7熒光實時定量PCR(qPCR)檢測 收集各組細胞樣品加入200 μl TRIzol裂解液，充分吹打至透明提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒操作流程獲得cDNA；按如下反應體系：上下游引物各1 μl、去RNA酶水2 μl、樣品cDNA 1 μl和SYBR Green MIX 5 μl進行qPCR分析；95℃，5 min；40個PCR循環(95℃，15 s；5℃，30 s)。每個樣品3復孔，依據PCR熔解曲線獲得Cq值；再根據2-ΔΔCt公式計算目標基因的相對表達量。E-Cadherin：上游序列：CTGATGCTGATGCCCCCAATA，下游序列：CTGCATCTTGCCAGGTCCTT；N-Cadherin：上游序列：ATCAAGCCTGTGGGAATCCG，下游序列：AGCTGTGGGGTCATTGTCAG；Collagen Ⅰ：上游序列：CATGACCGAGACGTGTGGAA，下游序列：GGCAGTTCTTGGTCTCGTCA；α-SMA：上游序列：TAGCACCCAGCACCATGAAG，下游序列：CTGCTGGAAGGTGGACAGAG；GAPDH：上游序列：GCCAAGGCTGTGGGCAAGGT，下游序列：TCTCCAGGCGGCACGTCAGA。

1.8Western印跡 收集并加入RIPA細胞裂解液到各組細胞樣品，4℃超聲裂解5次，12 000 r/min離心10 min取上清；按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒，根據蛋白標準曲線，測定上述各組樣品蛋白濃度，調整上樣質量為每孔30 μg蛋白，上樣于丙烯酰胺凝膠(5%濃縮膠/12%分離膠)。再利用電泳緩沖液(pH=8.8) 在80～110 V電壓下電泳1.5 h，之后利用轉膜緩沖液(pH=6.8)、110 V電壓濕法轉膜到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜 1.5 h。接著用5% BSA-TBST封閉液室溫搖晃1 h，按照蛋白Marker進行剪膜，并按照說明書配制相應濃度的一抗稀釋液，4℃搖床過夜；再用TBST溶液清洗5次，5 min/次，加入終濃度1∶5 000的二抗稀釋液，室溫搖晃1 h，再用TBST溶液清洗5次，5 min/次；最后使用ProteinSimple凝膠成像系統進行發光顯色，拍照記錄條帶。

1.9統計學方法 采用Graphpad Prism9.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1MTT法檢測A549細胞增殖存活情況 與對照組相比，TGF-β1組OD值分別在24、48 h時出現升高(均P<0.05)，72 h有少量下降。與TGF-β1組比較，WFBQTL 62.5 μg/ml、125.0 μg/ml、250.0 μg/ml、500.0 μg/ml組抑制TGF-β1誘導的A549細胞增殖并伴有濃度依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)，其作用48 h和72 h抑制增殖效果明顯，見表1。

2.2倒置顯微鏡觀察A549細胞形態改變 顯微鏡下可見TGF-β1刺激的A549細胞偽足拉長，細胞核皺縮，細胞密度變大。WFBQTL作用72 h后，A549細胞隨著濃度的加大細胞形態逐漸恢復，細胞密度逐漸減小，見圖1。

1～6：對照組；TGF-β1組；TGF-β1+WFBQTL 62.5 μg/ml組；TGF-β1+WFBQTL 125.0 μg/ml組；TGF-β1+WFBQTL 250.0 μg/ml組；TGF-β1+WFBQTL 500.0 μg/ml組圖1 顯微鏡下觀察不同分組細胞的形態(×40)

2.3qPCR法檢測A549細胞增殖及EMT相關基因的變化 與對照組相比，TGF-β1組降低E-Cadherin基因mRNA水平表達；與TGF-β1組比較，TGF-β1+WFBQTL 62.5 μg/ml、125.0 μg/ml、250.0 μg/ml組E-Cadherin表達明顯上調(均P<0.05)，呈濃度依賴性。而在TGF-β1誘導下，與對照組相比，TGF-β1組N-Cadherin、Collagen Ⅰ和α-SMA基因表達均明顯升高(均P<0.05)；與TGF-β1組比較，TGF-β1+WFBQTL 62.5 μg/ml、125.0 μg/ml、250.0 μg/ml組N-Cadherin、Collagen Ⅰ和α-SMA基因表達明顯降低(均P<0.05)，其中高劑量組最顯著。見表2。

2.4Western印跡法檢測A549細胞增殖及EMT相關蛋白的變化與對照組相比，TGF-β1組細胞E-Cadherin蛋白表達明顯下降，而N-Cadherin、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白表達均明顯升高(P<0.05)；與 TGF-β1組比較，TGF-β1+WFBQTL 62.5 μg/ml、125.0 μg/ml、250.0 μg/ml組細胞中E-Cadherin蛋白表達明顯上升，N-Cadherin和Collagen I蛋白表達逐漸下降(均P<0.05)；對α-SMA的表達有輕度抑制作用，見圖2，表3。

圖2 Western印跡結果

3 討 論

研究顯示，有很多潛在因子能夠激活特發性肝纖維化(IPF)中EMT的發生，在分離培養的氣道上皮細胞中，TGF-β1能促進上皮細胞發生EMT〔6〕。TGF-β1是目前公認導致肺纖維化的重要細胞因子，在肺纖維化的形成中起決定性作用〔7，8〕，能促進大量炎癥因子的產生并趨化至特定組織，進而影響成纖維細胞的增殖，導致間質化的發生〔9〕。WFBQTL源于吉林省名中醫宮曉燕教授治療肺纖維化臨床經驗方，本病隸屬于“肺痹”范疇，病機關鍵是毒損肺絡，瘀而滯久，從寒、從痰、從瘀，故以溫肺通絡為治療大要。本研究發現WFBQTL在處理TGF-β1誘導的A549細胞增殖過程中能夠起到明顯的抑制作用，在不同時間段采用濃度梯度WFBQTL處理后，細胞的增殖水平出現下調趨勢并呈濃度依賴、時間依賴。本研究結果提示WFBQTL可改善EMT過程，通過EMT相關標識物的檢測進一步證實上述結論，主要包括E-Cadherin、N-Cadherin、Collagen Ⅰ、α-SMA。

E-Cadherin是一類依賴鈣離子而存在的黏附因子，能促使細胞與細胞間形成穩定的黏附帶，維持上皮組織穩定。若E-cadherin的表達被抑制，上皮細胞間的接觸連結結構會被破壞，進而促進上皮細胞發生EMT，轉變為類似具有高度運動潛能的間質細胞〔10，11〕。E-Cadherin的抑制是整個EMT的核心環節〔12〕。本研究結果表明WFBQTL能夠對細胞骨架及結構的完整性起到保護作用。N-Cadherin與E-Cadherin同屬于經典Ⅰ類鈣黏蛋白，被稱作“黏附開關”，Lade-Keller等〔13〕研究證實N-Cadherin表達上調與細胞增殖遷移轉移呈正相關，N-Cadherin也被作為促進細胞EMT的啟動因子〔15〕，本研究結果推測WFBQTL能夠抑制細胞的遷移轉移功能。Collagen Ⅰ是細胞外基質及間充質的主要組成成分之一，通過調控膠原的遷移起到維持細胞骨架穩定性的作用，研究發現Collagen Ⅰ的積累能夠誘發組織及組織間隙的炎癥，能夠誘導組織纖維化的發生〔16〕，WFBQTL在處理TGF-β1誘導的A549細胞上Collagen Ⅰ蛋白下降，說明WFBQTL通過降低Collagen Ⅰ的表達，調控細胞周圍膠原的遷移能力，降低了細胞間質化水平。α-SMA是EMT的主要標志蛋白，存在于干細胞與前體細胞的肌動蛋白中，研究表明幾乎所有的成纖維組織及纖維組織表達α-SMA〔17〕，α-SMA在參與機體、細胞纖維化的同時能夠調節細胞間質化，是肌成纖維細胞產生的標志〔18〕；經過WFBQTL處理后，在發生EMT的細胞上α-SMA蛋白表達發生下調。

綜上，WFBQTL能夠下調肺纖維化與增殖相關蛋白N-Cadherin、Collagen Ⅰ、α-SMA的表達，通過回調E-Cadherin蛋白起到保護細胞膜的完整性，修復細胞損傷，抑制細胞發生間質化的作用。