絕經后骨質疏松癥差異表達lncRNAs及其靶基因抑瘤素M在外周血的表達研究

李生強 謝冰穎 陳娟 謝麗華 葉云金 黃景文 葛繼榮

福建省中醫藥科學院骨質疏松證候基因組學研究室，福建 福州 350003

隨著老齡社會的到來，骨骼健康逐漸引起人們的重視。骨質疏松癥以骨骼脆弱和微結構退化為特點，主要出現在絕經后婦女，與椎體和非椎體骨折的風險增加密切相關。骨質疏松癥導致的骨折是最常見的殘疾原因之一，具有較高的致死率，給社會和家庭帶來沉重的醫療負擔。因此骨質疏松癥的發病機制及防治研究具有重要的臨床和公共衛生意義[1-2]。絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于舊骨的清除(骨吸收)與新骨的產生(骨生成)之間平衡受到破壞，從而引起骨微結構破壞，造成骨量下降[2]。這種動態平衡受到許多因素的影響與調節等。長鏈非編碼RNA(1ong noncoding RNA，lncRNA)是長度超過200個核苷酸且沒有蛋白編碼能力的轉錄本，大量證據表明，lncRNA參與了多種分子機制和疾病[3-4]。前期課題組以lncRNA-mRNA芯片技術為手段，比較分析PMOP患者與對照組外周血lncRNAs 表達譜變化，獲得了差異表達lncRNAs[5]。本研究在lncRNA-mRNA共表達分析的基礎上，分析差異表達lncRNAs及其靶基因的關系，預測lncRNAs二級結構，從臨床納入人群驗證 lncRNAs及靶基因的表達變化，為從長鏈非編碼RNA角度闡釋骨質疏松癥的機制提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1研究對象：從常住福州地區的漢族絕經后婦女中隨機選擇受試者，進行血常規、尿常規、肝功、腎功能、腹部B超和心電圖等檢查，結合問卷調查排除嚴重疾病者；采用雙能 X 線骨密度儀檢測受試者正位腰椎(L2-4)、左側股骨頸、大轉子和 Ward區骨密度(g/cm2)；根據骨密度檢測結果，納入骨質疏松癥組及對照組各25例。

納入標準：①骨質疏松癥診斷標準參照《中國人骨質疏松癥建議診斷標準(第二稿)》[6]；②受試者均簽署知情同意書。本研究方案獲得福建省中醫藥研究院中醫藥臨床研究倫理委員會審批通過[7]。

排除標準：①不符合中國人骨質疏松癥診斷標準者；②類風濕性關節炎、糖尿病、甲狀腺功能亢進等繼發性骨質疏松癥者；③合并有心腦血管、胃腸道等嚴重疾病者；④肝、腎功能檢查異常者；⑤近 3個月內用激素替代治療，使用降鈣素者；近 6 個月內有連續 15 d 用雙膦酸鹽等防治骨質疏松癥者[7]。

1.1.2主要儀器和試劑：Discovery W 雙能 X 線骨密度儀(變異系數1.0 %，精度0.25 %，美國Hologic 公司)；微量核酸檢測儀 Nanodrop ND-2000 (美國 Thermo scientific公司)；實時熒光定量 PCR 儀(7500 fast美國 ABI公司)；人外周血淋巴細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)；Trizol 試劑 (美國Invitrogen 公司)；引物合成、反轉錄試劑盒、SYBR定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1LncRNA 靶基因預測：在lncRNA-mRNA 共表達分析的基礎上，利用blat工具對 lncRNA和mRNA(3'UTR)序列進行比對。序列相似的 lncRNA與mRNA(相關系數大于0.85且P值小于0.05)預測為具有靶向調節關系。

1.2.2LncRNA二級結構預測：打開RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)網址，分別輸入lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1全長序列，分別對其二級結構進行預測分析。

1.2.3總RNA抽提及反轉錄：抗凝采血管采集受試者空腹外周血2 mL，逐滴加入到淋巴細胞分離液，1 500 r/min離心15 min，小心吸出中間白色細胞層，并用生理鹽水重懸、離心；Trizol法抽提細胞中的總RNA；微量核酸檢測儀檢測吸光度值，分析RNA的純度并計算濃度。采用兩步法進行反轉錄，每個樣品取1 μg總RNA用于反轉錄合成cDNA，并于-80 ℃保存。

1.2.4實時熒光定量PCR驗證：定量PCR采用 20 μL反應體系：SYBR mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX dye II 0.4 μL，稀釋10倍的cDNA 2 μL，dd H2O 6.8 μL；一個樣品中的一個基因做3個重復孔；PCR反應步驟及相對表達量2-△△Ct法參照前期發表文獻[7]。上下游引物序列及擴展產物大小見表1。

表1 定量PCR上下游引物序列Table 1 Upstream and downstream primer sequences for RT-PCR

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據統計分析，計量資料采用均數±標準差描述。根據數據是否正態分布，選擇非參數檢驗或t檢驗比較組間差異，以P<0.05 判斷為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA 靶基因預測結果

LncRNA 靶基因預測結果見表2。

表2 LncRNA靶基因預測Table 2 Prediction of target genes of lncRNAs

2.2 LncRNA二級結構預測

由于堿基數較長，研究表明LncRNA能形成保守的二級結構，對于它們參與復雜的調控作用起著重要作用。RNAfold 軟件進行 lncRNAs結構預測，結果表明，lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1均含有多個莖環及多分枝內部環結構(見圖 1)。lncRNA 系列越長，如linc-FAM126B-1包含更多的環形結構(圖 1C)，其二級結構越復雜，可能參與更多的生物學功能。

注：1 A：lncRNA TTC28-AS1；1B：linc-IRF2BP2-1；1C：linc-FAM126B-1。圖1 RNAfold 預測 lncRNAs MEF 二級結構圖Fig.1 MEF secondary structure of lincRNAs predicted with RNAfold software

2.3 兩組人群基礎資料及骨密度比較

骨質疏松癥組及對照組人群基礎資料見表2，兩組人群在年齡、初潮年齡、懷孕次數、絕經年齡及BMI指數等方面差異均無統計學意義，結果具有可比性。與對照組相比，骨質疏松癥組在腰椎及Ward區骨密度顯著下降(P值均小于0.05)，兩組骨密度比較見表4。

表3 受試者基礎資料比較Table 2 Comparison of basic data of the

表4 受試者骨密度比較Table 3 Comparison of bone mineral density of the g/cm2)

2.4 定量PCR檢測抑瘤素M及lncRNAs在兩組人群中的表達

定量PCR結果表明，OSM在骨質疏松癥組人群外周血中表達顯著降低，與對照組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)；lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1等在骨質疏松癥組人群中表達水平顯著降低，與對照組相比，差異具有統計學意義(P值均小于0.05)，見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05。圖2 定量PCR檢測基因表達水平Fig.2 Expression level of the genes detected with real-time PCR

3 討論

隨著測序技術的迅速發展，越來越多的基因組轉錄本得到研究，從而產生了大量的長鏈非編碼(long chain non-coding RNA,lncRNA)。雖然科學家已經掌握了許多DNA調節元件(如增強子、啟動子)的調控特點，但是，鑒定及功能性研究仍然是當前lncRNA研究的首要任務[8-9]。從2018年開始，日益增長的研究表明，lncRNA在骨代謝中起著重要作用，許多長鏈非編碼RNA被發現參與多種骨代謝疾病的發生、發展及轉歸過程[10-13]。在骨質疏松癥，長鏈非編碼RNA主要參與了成骨細胞分化[14-16]、破骨細胞分化[17]及細胞信號通路激活[2,16]等調節過程，在骨生成與骨吸收動態平衡中起著重要調節作用。

本研究在獲得絕經后骨質疏松癥差異性lncRNA及mRNA的基礎上[5]，進行lncRNA-mRNA共表達分析，利用blat 工具預測lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1的靶基因可能為抑瘤素M(OSM)。目前國內尚沒有OSM與骨代謝的相關報道，但在國外已有相關研究。OSM作為白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)家族成員，是具有調節基因活性、抑制腫瘤增殖等生物學活性的分泌性糖蛋白[18-19]。骨細胞、成骨細胞和巨噬細胞均能以旁分泌的形式產生OSM。研究表明，OSM既可促進成骨細胞成骨分化，又能間接促進破骨細胞生成，是具有雙向調節作用獨特細胞因子[20-22]。OSM與受體(oncostatin M,OSMR)結合后可啟動下游的廣泛的信號通路[22]。OSM基因敲除小鼠具有成骨細胞數量降低、骨小梁減少的特征，表明OSM具有促進成骨細胞分化的功能[23]；OSMR敲除小鼠實驗表明OSM可能通過影響成骨細胞的RANKL (receptor activator of nuclear factor κB ligand)表達，負向調節破骨細胞功能[24]。本研究中，樣品來自人的外周血，OSM在絕經后骨質疏松癥組表達水平下降，這可能與吞噬細胞、破骨細胞分化能力相關，表明外周血OSM的表達與PMOP具有相關性。在前期六味地黃丸治療絕經后骨質疏松癥患者的臨床試驗中，課題組發現患者治療3個月后，外周血OSM的表達具有上升趨勢，表明OSM可能是六味地黃丸治療POP的靶標之一[25]。

生物體內RNA較少單獨存在，它們往往與具有特定功能的蛋白質特異性結合從而發揮生物學功能，特異性結合就要求RNA具有一定的結構特征。RNA的二級結構會影響到RNA的生物學功能[26]。通過在線預測RNAfold預測得到lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1的二級結構，它們均具有多個莖環、多分枝內部環，系列最長的linc-FAM126B-1其結構也最復雜，具有最多的莖環結構，說明它可能參與更多的生物學功能。LncRNA二級結構預測結合LncRNA功能研究，對于預測具有某種功能的結構單元、尋找藥物治療靶標具有重要意義。

在前期芯片檢測中，我們發現，lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1及OSM在絕經后骨質疏松癥組表達均出現下調。本研究結果表明，與對照組相比，骨質疏松癥組lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1及其靶基因OSM表達水平均顯著下降，與芯片檢測結果一致。外周血lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1及其靶基因OSM的表達下調，可能與絕經后骨質疏松癥相關。

本文不足之處在于本研究中臨床例數還偏少，LncRNAs與OSM的靶向調節關系還需要進一步的實驗驗證，我們也將開展lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1相關功能性實驗。

綜上所述，本實驗結果證明lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1 及其靶基因 OSM 基因在絕經后骨質疏松癥中表達顯著下調，它們可能為絕經后骨質疏松癥的重要關聯基因。本文從調控 PMOP的關聯長鏈非編碼RNAs及其靶基因OSM 入手，為闡明 PMOP的分子機制提供新的研究思路。