AN04-2治療骨質疏松的成藥性評價

宋燕 許元生 張時群 吳才梅 湯宇晴

廣州領晟醫療科技有限公司，廣東 廣州 10667

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少和骨微結構破壞為特征，導致骨強度下降，脆性增加和易于骨折的代謝性骨病[1]。伴隨人口老齡化，骨質疏松已成為全世界關注的老年疾病之一。研究表明，2016年中國60歲以上的老年人骨質疏松癥患病率為36 %，其中男性為23 %，女性為49 %，骨質疏松癥已成為我國面臨的重要公共衛生問題[2]。骨質疏松患者骨折發生率高，可引起和加重心腦血管疾病等，對患者的生理、心理健康危害極大，并大大降低生活質量，也給社會帶來了嚴重經濟負擔[3]。

骨質疏松治療藥物有很多，但絕大多數為骨吸收抑制劑(如雌激素受體調節劑[4]、雙膦酸鹽[5]、RANKL抑制劑[6]、降鈣素[7]等)，而骨形成促進劑(如甲狀旁腺素類似物[8]、阿巴帕肽[9]等)的種類卻非常少。從藥物的治療效果來看，局限在改善癥狀，延緩病情發展的水平，尚未達到疾病改善甚至治愈的效果，故而現有治療方式并不能滿足臨床需求。

AN04-2是新型的骨質疏松治療藥物，為骨關節炎治療多肽LH021與人血白蛋白(HSA)的融合蛋白，具有促進骨形成和抑制骨吸收的雙重作用，有可能用于骨質疏松的治療。本研究的目的是評價AN04-2治療骨質疏松的成藥性，為進入臨床前研究提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

野生型AB系斑馬魚，年齡為受精后3 d(3 dpf)，委托浙江杭州環特生物公司進行AN04-2治療斑馬魚骨質疏松的研究；12周齡SD大鼠，雌性，購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司，委托澎立生物醫藥技術(上海)有限公司進行AN04-2治療大鼠骨質疏松的研究。8周齡SD大鼠雌雄各半，體重180～220 g，購自中山大學試驗動物中心，委托廣州易沃路科技有限公司進行AN04-2單次給藥毒性研究。

1.2 試劑與藥品

重組人BMP-2 蛋白購自R&D公司，貨號為355-BM/CF；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒，購自碧云天生物，貨號為P0321；潑尼松，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為A1508012；鈣黃綠素(Calcein)，購自美國sigma公司，批號為C0875-5G；鹽酸依替膦酸二鈉水合物(簡稱依替膦酸二鈉)，批號為MFCD00152567，由東京化成工業株式會社生產。特立帕肽注射液(PTH)，批號C879391D，生產廠家為法國Lilly，規格為2.4 mL/支。

1.3 AN04-2體外對人成骨細胞ALP表達的影響

方法參考文獻[10-11]并有所改變：人成骨細胞hFOB1.19復蘇后，加入MEM培養基，于5 %CO2、37 ℃、飽和濕度下培養至對數生長期。取對數生長期的hFOB1.19細胞，計數，調整細胞濃度為1*105個/mL，培養于96孔板，每孔100 μL，加入終濃度為0.1、0.3、1、3、10 μmol/L的AN04-2進行處理，以同體積的PBS作為陰性對照，40 ng/mL的骨形態發生蛋白2(BMP-2)作為陽性對照，處理7 d后，以堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒檢測各組的ALP的表達。

1.4 AN04-2對斑馬魚骨質疏松模型的治療作用

方法參考文獻[12-14]并有所改變：隨機選取受精后3 d正常野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每組30尾，用潑尼松誘導斑馬魚建立骨質疏松癥模型，分別注射給予不同劑量的AN04-2(5、15、50 ng/尾)，注射體積為10 nL。同時設置正常對照組(即未經潑尼松誘導的斑馬魚)、模型對照組、陽性對照組，正常對照組與模型對照組均注射同體積的生理鹽水，陽性對照組水體給予150 μg/mL的依替膦酸二鈉，28 ℃培養箱孵育96 h后，用0.2 %鈣黃綠素進行染色，染色后進行拍照并采集數據，分析統計斑馬魚脊椎骨熒光強度，以有統計學意義評價供試品對潑尼松誘導的斑馬魚骨質疏松癥的治療作用。

1.5 AN04-2對大鼠骨質疏松模型的治療作用

方法參考文獻[15-18]并有所改變：12周齡雌性SD大鼠隨機分為6組，每組10只。動物以1.5 %～3.0 %異氟烷麻醉后，碘伏消毒皮膚，在下腹中線作縱行切口，鈍性分離皮下組織暴露腹正中線，在腹白線切開腹膜，鈍性游離出一側卵巢，沿卵巢基底部鉗夾骨盆漏斗韌帶血管、系膜及卵巢固有韌帶，完整切除卵巢，交叉貫穿縫合殘端，同樣的方式切除另一側卵巢。檢查有無活動出血，無出血，連續縫合創面，關閉腹腔。假手術組不切除卵巢，以卵巢周圍部分脂肪替代，其他操作相同。所有動物術后連續3 d給予一定量的鎮痛劑痛立定，每日一次。所有動物手術結束后給予一定量的抗生素。麻醉恢復期動物允許自由的活動及完全負重，動物實驗人員在麻醉恢復期須密切監控所有動物。

手術后第2天開始給藥治療，AN04-2低、中、高劑量組分別給予0.06、0.6、6 m/kg的AN04-2，假手術組與模型對照組給予生理鹽水，給藥體積為1 mL/kg，給藥方式為每周1次皮下注射；陽性對照組給予市售的特立帕肽注射液(PTH，Lily)，劑量為10 μg/kg，給藥方式為每日1次皮下注射。

分別于實驗開始前、實驗中每周1次，及實驗結束時測量記錄稱重。治療12周后，處死動物，取材腰椎L5及右股骨，采用DXA骨密度儀(Hologic Discovery Wi，USA；Hologic APEX 3.1.2軟件)檢測松質骨面積骨密度(BMD)。

1.6 安全性初步評價

180～220 g的SD大鼠30只，按體重隨機分為3組，每組10只，雌雄各半，分別為溶媒對照組、AN04-2低、高劑量組。AN04-2低、高劑量組分別給予50、100 mg/kg的AN04-2，給藥方式為靜脈單次注射，給藥體積為5 mL/kg，溶媒對照組給予相同體積的生理鹽水。給藥后持續觀察動物的反應情況，給藥后第1、3、5、7、14天分別稱重1次，連續觀察14 d，記錄一般狀態及體重等[19]。

給藥后立即觀察動物的反應情況，并持續觀察12 h，觀察內容包括動物體重、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物等變化，記錄動物的死亡情況、中毒癥狀及中毒反應的起始時間、嚴重程度、持續時間等。

給藥后第 14 天，麻醉動物并安樂死，進行大體解剖檢查，肉眼觀察各器官和組織的變化，并記錄出現異常的組織和器官。

1.7 統計學處理

利用GraphPad Prism (GraphPad Software,Inc.) 進行數據分析。采用單因素方差分析法分析組間平均值。若差異較大，則采用Dunnett’s校驗法進一步分析。當P<0.05時為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AN04-2體外對人成骨細胞的作用

與模型對照組(生理鹽水)相比，0.3～10 μmol/L濃度的AN04-2可顯著促進人成骨細胞HFOB1.1的ALP的表達(P<0.01)，且量效關系明顯(圖1)，提示AN04-2具有促進成骨的作用。

圖1 AN04-2對人成骨細胞ALP表達的影響Fig.1 Effect of AN04-2 on ALP expression in human osteoblasts

圖2 AN04-2對斑馬魚骨質疏松模型的治療作用(拍照)Fig.2 Therapeutic effect of AN04-2 on zebrafish osteoporosis model

2.2 AN04-2對斑馬魚骨質疏松模型的治療作用

潑尼松龍誘導，建立斑馬魚骨質疏松模型。與正常對照相比，模型對照組斑馬魚脊椎骨熒光強度顯著下降(P<0.001)，表明模型構建成功。與模型對照組相比，陽性對照組斑馬魚脊椎骨熒光強度顯著升高(P<0.001)，表明試驗系統成立，可用于評價藥物對骨質疏松的治療作用。

與模型對照組相比，劑量為15、50 ng/尾的AN04-2治療，斑馬魚脊椎骨熒光強度顯著升高(P<0.001)，骨密度分別比模型對照組增加74.58 %和62.88 %，劑量為5 ng/尾的AN04-2治療，斑馬魚脊椎骨熒光強度則沒有明顯的升高(P>0.05)(表1、圖3)，提示AN04-2對潑尼松誘導的斑馬魚骨質疏松具有劑量依賴的治療作用。

表1 AN04-2對斑馬魚骨質疏松模型的治療作用Table 1 Therapeutic effect of AN04-2 on zebrafish osteoporosis

2.3 AN04-2對大鼠骨質疏松模型的治療作用

治療12周后，與假手術組相比，模型對照組第五腰椎(L5)和右股骨的BMD明顯降低(P<0.01)，顯示模型構建成功。與模型對照組相比，陽性對照組(PTH治療)第五腰椎和右股骨的BMD明顯升高(P<0.01)，提示試驗系統成立，可以用于評價藥物對骨質疏松的治療作用。

與模型對照組相比，1周1次皮下注射不同劑量的AN04-2，治療組第五腰椎和右股骨的BMD有升高的趨勢(表2)，但差異并沒有統計學意義(P>0.05)，顯示1周1次皮下注射AN04-2對于骨質疏松雖有一定的治療作用，但治療作用較弱，與每日1次皮下注射的市售陽性藥物(PTH)相比，并沒有明顯的治療優勢，可能提示AN04-2的半衰期不能支持1周1次的給藥周期。

表2 AN04-2對大鼠骨質疏松模型的治療作用Table 2 Therapeutic effect of AN04-2 on rat osteoporosis

2.4 安全性初步評價

給藥治療期間，各組大鼠均活動正常、毛發光滑，體重呈正常增長，未見明顯異常反應，各組動物均無死亡。體重變化如表4所示。

表3 各組體重變化及死亡情況Table 3 Weight change and death in each treatment

AN04-2處理14 d后，處死各組大鼠，進行大體剖檢。各組大鼠臟器形態、重量均正常，未見明顯異常。

SD大鼠靜脈注射給予AN04-2高至100 mg/kg，未見明顯不良反應。靜脈注射的最大耐受劑量(MTD)為100 mg/kg。

3 討論

AN04-2是新型的擬用于治療骨質疏松的融合蛋白藥物，本文對其治療骨質疏松的成藥性進行評價，以推動其盡快進入臨床前開發。

眾所周知，骨質疏松目前的治療藥物很多，但絕大多數為骨吸收抑制劑(如雌激素受體調節劑、雙膦酸鹽、RANKL抑制劑、降鈣素等)，而骨形成促進劑(如甲狀旁腺素類似物、阿巴帕肽等)的種類卻非常少。在體內外試驗中，AN04-2可以顯著的促進成骨細胞ALP的表達，顯著提高斑馬魚脊椎骨的骨密度，屬于新型的骨形成促進劑，這是該藥物獨特的作用特點。

AN04-2對大鼠骨質疏松模型的治療作用則較弱，藥效不及市售藥物PTH。但需要注意的是，AN04-2為每周注射1次，而PTH為每日注射，AN04-2的給藥頻率遠遠低于PTH，這可能影響了AN04-2的藥效作用。后續有必要考察AN04-2每周2次或者每日1次與PTH的藥效比較。

AN04-2的安全性非常好，大鼠靜脈注射高至100 mg/kg，無任何毒性反應。良好的安全性，有利于保證其臨床應用。

綜上所述，AN04-2可顯著提高骨質疏松模型的骨密度，同時安全性好，具有較好的成藥性，后續優化其給藥周期，則有希望開發為治療骨質疏松的新型藥物。