當(dāng)歸多糖促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞系H9c2增殖

楊 萍，代 天，張?zhí)K川

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院)心血管內(nèi)科, 湖北 武漢 430015)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy)是一種嚴(yán)重的疾病，特征是心室擴張和心臟功能障礙。作為人類最常見的心肌病形式，擴張型心肌病約占所有心肌病的60%，也是心力衰竭和心臟移植的主要原因[1-2]。現(xiàn)階段，擴張型心肌病的臨床治療尚未獲得令人滿意的結(jié)果，并且患者的預(yù)后極差，其5年生存率低于50%[3-4]。因此，有必要進(jìn)一步開發(fā)新的治療策略來改善擴張型心肌病。當(dāng)歸是一種常用的中藥，具有造血、抗氧化、抗感染、免疫調(diào)節(jié)、抗細(xì)胞凋亡和抑制血小板聚集的藥理活性[5]。當(dāng)歸多糖(angelica polysaccharide，APS) 是從當(dāng)歸根中提取的主要的水溶性成分，可以通過激活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor-6，ATF6)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞系H9c2凋亡，從而保護(hù)心臟免受缺血性損傷[5]。當(dāng)歸多糖還能以濃度依賴方式減少缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡，改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[6]。但是，目前尚無有關(guān)當(dāng)歸多糖對擴張型心肌病影響及機制的報告。微小RNA(microRNA，miRNA)-4701-3p是重要的miRNA之一，其調(diào)節(jié)功能已在各種癌中被報道[7]。既往研究表明，miR-4701-3p在擴張性心肌病患者中相較于正常對照高表達(dá)[8]。但是，miR-4701-3p是否參與當(dāng)歸多糖對擴張性心肌病大鼠心肌細(xì)胞的調(diào)節(jié)仍不清楚。因此，本研究以大鼠心肌細(xì)胞H9c2為對象，利用阿霉素(adriamycin，ADR)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，模擬擴張型心肌病，評價當(dāng)歸多糖在細(xì)胞增殖和凋亡中的功能及潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與試劑

鼠源H9c2細(xì)胞系(中科院上海細(xì)胞庫)，當(dāng)歸多糖APS(Solarbio公司)；ADR(輝瑞制藥有限公司)；Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)培養(yǎng)基(Gibco公司)；anti-miR-4701-3p及陰性對照anti-miR-NC(廣州銳博公司)；B型腦鈉肽(B-type natriuretic peptide, BNP)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)；Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BestBio公司)；抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)、抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、抗細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki-67(nuclear associated antigen Ki67, Ki-67)、抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體(Abcam公司); 實時定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)相關(guān)試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理：用含10%胎牛血清和1%青鏈霉雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在飽和濕度、37 ℃和5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)H9c2細(xì)胞。將H9c2細(xì)胞分為對照組(control組)、ADR誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞復(fù)制擴張性心肌病心肌細(xì)胞組(ADR組)。當(dāng)歸多糖(angelica polysaccharide，APS)干預(yù)(APS組)、轉(zhuǎn)染anti-miR-NC(APS+anti-miR-NC組)及轉(zhuǎn)染anti-miR-4701-3p(APS+anti-miR-4701-3p組)。轉(zhuǎn)染時按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的步驟，在細(xì)胞匯合至60%的H9c2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-4701-3p和anti-miR-NC，根據(jù)分組進(jìn)行其他處理。其中，control組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞，ADR組用3 mg/L ADR作用H9c2細(xì)胞12 h，APS組用250 mg/L當(dāng)歸多糖預(yù)處理細(xì)胞24 h，之后進(jìn)行ADR損傷，APS+anti-miR-NC組或APS+anti-miR-4701-3p組細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-NC或anti-miR-4701-3p,使用250 mg/L當(dāng)歸多糖處理24 h后，進(jìn)行ADR損傷。

1.2.2 流式細(xì)胞計量術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：收集各組H9c2細(xì)胞，用冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，在400 μL結(jié)合緩沖液中懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/mL。之后加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于4 ℃避光反應(yīng)15 min，加入10 μL PI并輕輕混勻，于4 ℃避光反應(yīng)5 min，置流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.2.3 Western blot檢測Bcl-2、Bax、Ki-67、PCNA表達(dá):向各組H9c2細(xì)胞中加入RIPA裂解液，進(jìn)行蛋白的提取。將提取的蛋白于沸水中變性10 min，并吸取30 μg進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。膜用5%脫脂奶粉封閉液封閉，之后與抗Bcl-2、抗Bax、抗Ki-67、抗PCNA和抗β肌動蛋白(β-actin)一抗，在4 ℃條件下孵育過夜。第2天，將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG一起孵育2 h，再通過ELC化學(xué)發(fā)光液顯色、顯影，通過Image J軟件分析Bcl-2、Bax、Ki-67、PCNA蛋白的水平。

1.2.4 ELISA法檢測BNP水平：構(gòu)建擴張性心肌病大鼠心肌細(xì)胞模型時，收集control組和ADR組H9c2細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒的說明，檢測BNP水平。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖:收集各組H9c2細(xì)胞，以1×104個/孔的數(shù)量接種于96孔板，向培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞中加入10 μL CCK-8溶液，孵育1 h，于酶標(biāo)儀測定細(xì)胞在450 nm波長處的吸光度A值，來表示細(xì)胞活力。

1.2.6 RT-qPCR檢測miR-4701-3p表達(dá):收集各組H9c2細(xì)胞，加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。通過PrimeScriptTMRT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。通過SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。miR-4701-3p的表達(dá)以U6為參照，由2-ΔΔCt方法計算得出。miR-4701-3p引物序列為5′-CCACCACAC CTACCCCTTGT-3′(F)和5′-ACACCACACCCATCAC CCAT-3′(R)，U6引物序列為5′-CTGGTAGGGT GCTCGCTTCGGCAG-3′(F)和5′-CAACTGGTGTC GTGGAGTCGGC-3′(R)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9c2凋亡

與對照組比較，ADR組H9c2細(xì)胞中BNP含量、細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平顯著升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)(圖1)。

A.flow cytometry to detect cell apoptosis; B.Western blot to detect the relative expression of Bcl-2 and Bax protein;*P<0.05 compared with control group

2.2 當(dāng)歸多糖對擴張性心肌病大鼠心肌細(xì)胞H9c2增殖的影響

與ADR組比較，APS組H9c2細(xì)胞的Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞活力明顯增加(P<0.05)(圖2)。

2.3 當(dāng)歸多糖對擴張性心肌病大鼠心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響

與ADR組比較，APS組細(xì)胞的凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯增加，Bax蛋白表達(dá)量顯著減少(P<0.05)(圖3)。

2.4 當(dāng)歸多糖對miR-4701-3p在擴張性心肌病大鼠心肌細(xì)胞H9c2中表達(dá)的影響

APS組H9c2細(xì)胞中miR-4701-3p表達(dá)量為1.62±0.16，顯著高于ADR組的1.00±0.09(P<0.05)。

2.5 敲減miR-4701-3p對當(dāng)歸多糖作用的擴張性心肌病大鼠心肌細(xì)胞H9c2增殖的影響

與APS組比較，APS+anti-miR-NC組細(xì)胞H9c2的Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)量、細(xì)胞活力、miR-4701-3p表達(dá)量無明顯變化； APS+anti-miR-4701-3p組H9c2細(xì)胞內(nèi)Ki-67、PCNA蛋白水平明顯降低，細(xì)胞活力顯著降低，miR-4701-3p表達(dá)量明顯減少(P<0.05)(圖4)。

A.MTT detected cell viability; B.Western blot to detect the relative expression Ki-67 and PCNA protein; *P<0.05 compared with ADR group

A.flow cytometry to detect cell apoptosis; B.Western blot to detect the relative expression of Bcl-2 and Bax protein;*P<0.05 compared with ADR group

2.6 敲減miR-4701-3p對當(dāng)歸多糖作用的擴張性心肌病大鼠心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響

與APS組比較，APS+anti-miR-NC組細(xì)胞H9c2的凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白水平無顯著變化；APS+ anti-miR-4701-3p組細(xì)胞H9c2的凋亡率明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著減少，Bax蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)(圖5)。

3 討論

現(xiàn)階段，擴張型心肌病的病因和發(fā)病機制仍不清楚。本研究采用阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9c2損傷，以構(gòu)建擴張型心肌病模型[9]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿霉素的使用導(dǎo)致心肌細(xì)胞H9c2的凋亡率和促凋亡蛋白Bax的蛋白表達(dá)量增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)量減少，并且，細(xì)胞中BNP含量升高，與報道[10-11]相符，因此，后續(xù)實驗在此模型的基礎(chǔ)上探討當(dāng)歸多糖的作用和機制。

當(dāng)歸多糖在心臟疾病方面表現(xiàn)出一定的預(yù)防和治療作用，例如缺氧-復(fù)氧導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞凋亡增加，而當(dāng)歸多糖可以起到減少其凋亡，產(chǎn)生保護(hù)缺氧-復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的效果[12]。在缺氧條件下，當(dāng)歸多糖的預(yù)處理通過下調(diào)miR-22的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕H9c2細(xì)胞損傷[13]。然而，當(dāng)歸多糖對阿霉素?fù)p傷大鼠心肌細(xì)胞H9c2的保護(hù)作用尚未得到充分報道。本實驗中，當(dāng)歸多糖可以增加阿霉素誘導(dǎo)后H9c2細(xì)胞的細(xì)胞活力，并減少細(xì)胞的凋亡，提示當(dāng)歸多糖可能對阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2損傷發(fā)揮保護(hù)和治療作用。

以前的研究證明了miR-4701-3p在擴張性心肌病患者中高表達(dá)[8]。結(jié)直腸癌HCT116中的miR-4701-3p被異惡唑衍生物SHU00238顯著下調(diào)，miR-4701-3p可以逆轉(zhuǎn)SHU00238對HCT116細(xì)胞凋亡的影響[14]。這項研究首次揭示了，當(dāng)歸多糖處理明顯上調(diào)了阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中miR-4701-3p的表達(dá)水平。更重要的是，敲減miR-4701-3p明顯減弱當(dāng)歸多糖作用的擴張性心肌病H9c2細(xì)胞的細(xì)胞活力、Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白水平，而增強其凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量，可見當(dāng)歸多糖預(yù)處理對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用被敲減miR-4701-3p所逆轉(zhuǎn)。綜合這些結(jié)果，說明當(dāng)歸多糖通過上調(diào)miR-4701-3p，使細(xì)胞增殖增加和細(xì)胞凋亡減少，來保護(hù)H9c2細(xì)胞免受阿霉素誘導(dǎo)的損傷。

A.qRT-PCR detected the expression of miR-4701-3p; B.MTT detected cell viability; C.Western blot to detect the relative expression of Ki-67 and PCNA protein; *P<0.05 compared with APS group

A.flow cytometry to detect cell apoptosis; B.Western blot to detect the relative expression of Bcl-2 and Bax protein;*P<0.05 compared with APS group

總之，當(dāng)歸多糖對阿霉素誘導(dǎo)的擴張型心肌病H9c2細(xì)胞損傷模型具有保護(hù)作用。當(dāng)歸多糖的預(yù)處理可通過上調(diào)miR-4701-3p，促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡來保護(hù)心肌細(xì)胞免受阿霉素誘導(dǎo)的損傷。這為了解當(dāng)歸多糖的心肌保護(hù)作用提供了證據(jù)，并為深入探討使用當(dāng)歸多糖預(yù)防和治療擴張型心肌病提供了理論依據(jù)。