下調Notch1基因促進人肝癌細胞系HepG2自噬

李長安，劉春秀，謝曉娟，孫愛平

(1.新鄉醫學院第三附屬醫院 感染科，河南 新鄉 453000； 2 新鄉醫學院 免疫學教研室，河南 新鄉 453000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床最常見的原發惡性腫瘤之一，每年全球新增肝癌患者高達63萬例，病死率居于各種惡性腫瘤的第二位。目前，HCC最重要的治療方法仍是手術切除[1-2]，但是外科手術切除具有嚴格的手術指征，且術后存在較高的復發率。部分肝癌患者在就診時已屬于肝癌晚期，就診時已喪失了最佳手術時機，因此，尋找HCC發生發展的分子機制具有重要臨床意義。Notch1信號通路是參與多種細胞的發育、增殖、分化和凋亡的重要通路[3]。而PI3K/Akt/mTOR信號途徑在細胞增殖、分化等生理過程中發揮重要作用。Notch1蛋白的表達可能參與了Akt/mTOR信號通路的激活[4]。自噬是高度保守的生命現象，主要是指細胞內溶酶體降解細胞內物質轉變成有用的物質供細胞利用，并排出廢物的過程，其貫穿了細胞的增殖、分化及凋亡各個階段。本研究觀察了Notch1基因的表達對肝細胞癌的增殖、凋亡及細胞內自噬水平及Akt/mTOR信號通路相關蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料：選擇2017年1月至2019年12月于新鄉醫學院第三附屬醫院行肝癌手術治療患者的肝癌組織32例作為肝癌組，同一部位的癌旁組織作為癌旁組。所有患者均于術后行病理檢查，確診為原發性肝細胞癌，并依據美國腫瘤聯合會(AJCC)第七版TNM分期系統進行分期，所有患者術前均未給予放療、化療或者靶向治療等抗腫瘤措施，且均未發現腫瘤遠處轉移。所有患者均知情同意，并簽署知情同意書。且本研究已獲得醫院倫理委員會批準(倫理審批號：20170119)。

1.1.2 試劑：人肝癌細胞系HepG2(ATCC公司)；RPMI1640培養液及胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)；LipofectamineTM2000轉染試劑、RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(Invitrogen公司產品)；AmiexinV/PI雙染試劑盒(BD公司)；Notch1、BCL-2、Bax、cleaved caspase-3、Akt、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K和β-actin鼠抗人一抗(均Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養及轉染：用含20%胎牛血清的RPMI1640培養液培養人肝癌細胞系HepG2進行傳代培養，培養條件：37 ℃、5% CO2、飽和濕度，當細胞呈對數增殖期時進行后續實驗。以2×106個/孔接種于6孔培養板上，分別設置對照組、NC siRNA組及Notch1 siRNA組，每組均設3個復孔。將Opti-MEM 250 μL與LipofetamineTM2000 15 μL、NC siRNA對照1.0 μg、Notch1 siRNA1.0進行稀釋，并于24 ℃下放置5 min后與NC siRNA及Notch1 shRNA混合，于24 ℃下放置20 min，并將轉染復合物加入含有細胞的無抗培養液中，繼續培養48 h后，檢測Notch1 mRNA及蛋白的相對表達水平。

1.2.2 熒光定量PCR檢測Notch1 mRNA的表達：RNA提取試劑盒提取肝癌組織及細胞的總RNA并合成cDNA。使用ABI 7500熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR的檢測。引物由Invitrogen公司設計并合成。引物序列：Notch1上游引物:5′-GCCTCAA CATCCCCTACAAGA-3′，下游引物:5′-CCACGAAG AACAGAAGCACAAA-3′；β-actin上游引物:5′-CG AGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGA-3′，下游引物:5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACA TCTGC-3′。PCR擴增步驟95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，共40個循環，并加測溶解曲線以驗證擴增產物的特異性。數據以2-△△Ct法進行分析。

1.2.3 MTT法檢測細胞的增殖：轉染48 h后，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下繼續培養細胞，分別于24、48、72和96 h收集細胞，將細胞置于96孔板中，每孔分別加入MTT 20 μL，繼續培養4 h，離心后棄去上清，每孔加入DMSO 150 μL，避光條件下振蕩混勻10 min，在492 nm和630 nm的波長上檢測細胞的增殖率，實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞測量術檢測細胞的凋亡：轉染48 h后，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下繼續培養細胞24 h，嚴格按照AnnexinV和PI雙染試劑盒的說明書處理細胞，流式細胞測量術檢測細胞的凋亡率。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測細胞凋亡相關蛋白、自噬相關蛋白及對Akt/mTOR信號通路相關蛋白的表達：轉染48 h后，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下繼續培養細胞24 h，離心收集細胞，加入含有磷酸酶抑制劑的細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量后，給予SDS-PAGE分離蛋白，轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗，4 ℃過夜后，加入1∶5 000比例的二抗，24 ℃孵育1 h，ECL化學發光法顯色，以β-actin為內參照，AlphaDigiDoc圖像分析軟件分析目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Notch1基因在肝癌組織中的表達

Notch1基因在原發性肝細胞癌組織中的相對表達量為(1.865±0.791)，顯著高于癌旁組織的(0.709±0.414)(P<0.001)。

2.2 下調Notch1的表達可抑制肝癌細胞的增殖

Notch1 siRNA組中Notch 1 mRNA及蛋白的表達均顯著低于NC siRNA組和對照組(P<0.001)(圖1A～C)。提示Notch1 siRNA轉染成功，Notch1的表達被成功抑制。 Notch1 siRNA組24、48、72及96 h的細胞增殖率顯著低于陰性對照組及空白對照組(P<0.001)(圖1D)。

2.3 下調Notch1的表達對肝癌細胞凋亡的影響

轉染48 h后，Notch1 siRNA組細胞的凋亡率顯著高于NC siRNA組和對照組(P<0.001)。且Notch1 siRNA組細胞的Bax水平顯著高于NC siRNA組和對照組，Bcl-2、cleaved caspase-3的表達顯著低于NC siRNA組和對照組(P<0.001)(圖2)。

2.4 下調Notch1的表達對肝癌細胞自噬相關蛋白的影響

轉染48 h后，Notch1 siRNA組細胞中自噬相關蛋白LC3B、Beelinl、ATG7和ATG5的表達量顯著高于NC siRNA組和對照組(P<0.001)(圖3)。

2.5 下調Notch1的表達對肝癌細胞中Akt/mTOR信號途徑相關蛋白的影響

轉染48 h后，Notch1 siRNA組的mTOR信號途徑相關蛋白p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K表達量顯著低于NC siRNA組和對照組(P<0.001)(圖4)。

3 討論

惡性腫瘤的病理形成過程發生發展中伴隨著Notch信號通路的異常活化[5-6]。Notch1是Notch受體中與腫瘤發生發展關系最為密切的基因。Notch1在肝細胞癌組織中的陽性表達率均高于癌旁肝硬化和癌旁正常組織，其對肝細胞癌的發生發展起促進作用[7]。干擾Notch1的表達能夠抑制肝癌細胞的侵襲、轉移[8]。因此，Notch1在肝癌的發生發展中發揮促癌基因的作用。本研究結果顯示，Notch1在原發性肝細胞癌組織中的相對表達量顯著高于癌旁組織。同時，下調Notch1的表達后，肝癌細胞HepG2 24、48、72及96 h的細胞增殖率顯著降低，凋亡率顯著增高，Bax水平顯著增高，Bcl-2、cleaved caspase-3的表達顯著降低，進一步證實了Notch1在肝癌組織中呈高表達，且其與肝癌細胞的增殖與凋亡密切相關。

A.expression of Notch1 protein detected by Western blot; B.bar graph of Notch1 protein expression; C.expression of Notch1 mRNA detected by fluorescence quantitative PCR; D.cell protiferation detected by MTT method;*P<0.001 compared with control and NC group

A： apoptosis of liver cancer cells by flow oytometry；B：expression of apoptosis-related proteins detected by Western blot; *P<0.001 compared with control and NC group

A.expression of autophagy-related proteins by Western blot; B.bar graph of autophagy-related protein expression;*P<0.001 compared with control group and NC group

A.expression of Akt/mTOR signaling pathway related proteins by Western blot; B.bar graph of Akt/mTOR signaling pathway related proteins expression;*P<0.001 compared with control group and NC group

自噬是細胞代謝過程進行自我消化的正常生理過程，在此過程中細胞內的物質由溶酶體降解并重新利用，同時排出代謝廢物，這一過程貫穿于細胞的全部生命活動過程中，對于維持細胞的內環境穩定、修復機體病理損傷發揮積極作用[9-10]。因此，在腫瘤細胞中提高細胞的自噬水平有利于抑制腫瘤細胞的增殖與發展。LC3B、Beelinl、ATG7和ATG5是機體自噬過程中重要的標志性蛋白[11-12]。本研究結果顯示，轉染48 h后，Notch1 siRNA組細胞中自噬相關蛋白LC3B、Beelinl、ATG7和ATG5的表達量顯著高于NC siRNA和對照組，提示抑制Notch1的表達可有效促進肝癌細胞的自噬。

P13K-Akt-mTOR信號通路在多種惡性腫瘤中呈現激活狀態，促進了腫瘤的發生發展[13-14]。在膠質瘤細胞中P13K-AKT-mTOR信號通路的表達上調，而給予mTOR抑制劑成功阻斷該通路后，膠質瘤細胞的自噬水平顯著升高，抑制腫瘤生長[15]。同時，Notch1基因與P13K-AKT-mTOR信號通路的激活密切相關。研究發現，在膠質瘤細胞中阻斷Notchl后，P13K-AKT-mTOR信號通路的活性也被抑制，細胞內自噬水平升高，促進了細胞的凋亡。本研究結果顯示，轉染48 h后，Notch1 shRNA組的mTOR信號途徑相關蛋白p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K表達量顯著低于NC siRNA和對照組，提示下調Notch1的表達能夠降低Akt/mTOR信號通路相關蛋白的磷酸化水平，抑制該通路的激活，而其抑制Notch1的表達可有效促進肝癌細胞的自噬可能與此有關。

綜上所述，Notch1在原發性肝細胞癌組織中呈高表達，而下調Notch1的表達可顯著抑制肝癌HepG2細胞的增殖，誘導細胞的凋亡，提高細胞的自噬水平，其機制可能與抑制Akt/mTOR信號通路有關。