Met-tRNAiMet載體蛋白在急性髓系白血病(AML)中的表達及功能

蘇鵬忠，何家驩，于 姍，王小爽，余 佳

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 生物化學與分子生物學系醫學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005)

mRNA的翻譯起始于核糖體小亞基(真核生物中的30S核糖體或原核生物中的40S核糖體)正確識別mRNA上的起始密碼子，核糖體小亞基P位點上起始tRNA(Met-tRNAiMet)的出現對于起始密碼子的識別至關重要。一類被稱為起始tRNA載體的翻譯起始因子促進Met-tRNAiMet向核糖體P位點的轉移[1]。真核生物中，eIF2是最主要的起始tRNA載體蛋白。現已發現，在多種應激狀態下，4種蛋白激酶可磷酸化eIF2的α亞基，通過隔離eIF2B而抑制eIF2正常結合起始tRNA并啟動翻譯的功能，從而導致大多數真核生物mRNA的翻譯受阻[2]。

研究發現，一些mRNA的翻譯不受到應激條件下eIF2α磷酸化造成的翻譯抑制調控。具體而言，eIF2A、eIF2D和MCTS1等蛋白能夠在丙型肝炎病毒(HCV) mRNA的內部核糖體位點(IRES)介導的翻譯中運輸tRNA。此外，eIF2α不依賴的翻譯起始能夠通過促進腫瘤相關mRNA的翻譯，幫助腫瘤細胞獲得選擇性生長優勢并逃避凋亡。例如，eIF2A在鱗狀細胞癌的發生過程中發揮重要的癌基因功能，eIF2A選擇性地調控癌基因的翻譯，從而促進了鱗狀細胞癌的發生[2]。MCTS1也是調控細胞周期和凋亡的重要原癌基因，其在83.9%的肺癌中表達上調，并在乳腺癌和淋巴瘤模型中促進惡性生長、血管形成、組織侵襲和抑制凋亡[3-4]。eIF2D在腫瘤發生中的功能還未見報道。除了上述在實體腫瘤中的研究報道，目前這些Met-tRNAiMet載體蛋白在成體造血分化和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)細胞中的功能尚不明確。

本研究旨在分析3個Met-tRNAiMet載體蛋白eIF2A、eIF2D和MCTS1在成體造血分化不同階段和AML細胞中的表達情況，并在AML細胞系MOLM13中初步研究這些蛋白對于AML發生發展的調控功能。

1 材料與方法

1.1 材料

高效RIPA裂解液(組織/細胞)(碧云天生物技術公司)；PG113 PAGE凝膠快速制備試劑盒、PS119 通用型抗體稀釋液、SQ101L Omni-ECLTM增強型化學發光檢測試劑盒(上海雅酶生物技術有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶生物技術有限公司)；PVDF膜(Millipore公司)；293T和MOLM13細胞系(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心)；兔源eIF2A、eIF2D、β-actin抗體(Proteintech公司)；山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；Neofect轉染試劑(北京碼音科技有限公司)；RPMI 1640 (#61870036)、DMEM(#11965092)和胎牛血清(Thermo Fisher公司)；細胞增殖檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒(東仁化學科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 shRNA干擾片段設計和載體構建：通過https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/網站設計針對eIF2A和eIF2D的干擾序列，eIF2A shRNA：5′-GCTACTGCTGTGTTGGTAATA-3′，eIF2D shRNA：5′-CGTCATTAACTACGCCAAGAA-3′。根據序列合成shRNA引物，將退火得到的片段構建進入plko.1載體，測序驗證shRNA序列的準確性。

1.2.2 AML細胞系培養：細胞系293T培養于DMEM，AML細胞系MOLM13培養于RPMI 1640，均加入10%胎牛血清。培養條件為5% CO2、37 ℃和飽和濕度。

1.2.3 慢病毒介導的質粒表達：在293T細胞中使用Neofect轉染試劑轉染shRNA載體，觀察細胞狀態，48～72 h后收集培養液上清。過濾上清后20 000 r/min離心3 h，收集病毒顆粒。離心得到的病毒顆粒用RPMI 1640基礎培養基重懸。為了在MOLM13細胞中感染shRNA載體，以濃度1×106/mL接種MOLM13細胞，每2×106/mL細胞加入100 μL慢病毒重懸液，同時加入polybrene以增加感染效率。感染14～16 h后收集細胞懸液，800 r/min離心5min，去上清后更換含有10%血清的RPMI 1640完全培養基。

1.2.4 免疫印跡法(Western blot)檢測蛋白表達：在處理后的相應時間點收集細胞，使用細胞裂解液提取總蛋白并測定蛋白濃度(BCA法)。每孔上樣20～30 μg總蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品。利用電轉儀將蛋白轉印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入eIF2A、eIF2D一抗(1∶1 000稀釋)，β-actin一抗(1∶10 000稀釋)4 ℃孵育12～16 h后，加入山羊抗兔IgG室溫孵育1 h。使用化學發光檢測試劑盒顯影，分析蛋白表達。

1.2.5 細胞增殖和周期檢測：采用CCK8試劑盒以及酶標儀檢測細胞增殖，具體方法參考試劑盒說明。以5 000個細胞/100 μL完全培養基的濃度，將慢病毒感染的MOLM13細胞接種至96孔板中。將96孔板在培養箱中常規培養24、48、72和96 h后，向每個孔中加入10 μL CCK8試劑，孵育2 h。利用酶標儀測定450 nm處的吸光度值，觀察統計細胞的增殖水平。

采用細胞周期檢測試劑盒以及流式細胞儀檢測細胞周期情況，具體方法參考試劑盒說明。收集慢病毒感染的MOLM13細胞，調整濃度為1×106/mL，并用PBS洗滌2次，之后用100 μL PBS重懸，并加入5 μL PI試劑，混勻后4 ℃染色30 min，補充PBS至總體積500 μL。使用流式細胞儀進行PI信號的檢測。得到的流式結果使用modfit軟件進行周期分析，記錄G1、S和G2/M期細胞所占的比例。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Met-tRNAiMet載體蛋白在小鼠造血干細胞分化不同階段的表達

首先檢測了Met-tRNAiMet蛋白在小鼠造血分化不同階段的表達變化(GSE142216)[5]。其中髓系分化包含12種類型的細胞，淋系分化包含8種類型的細胞。在髓系和淋系不同分化階段分別對3個替代蛋白的表達水平進行統計，并按照分化的過程進行排序，發現在髓系和淋系分化過程中eIF2A和eIF2D的表達水平在干細胞和祖細胞階段較高，而在成熟血液細胞中均呈降低趨勢(P<0.01)(圖1A～B, D～E)，而MCTS1在干祖細胞和成熟細胞中的表達沒有明顯的變化趨勢(P<0.05)(圖1C, F)。綜上，eIF2A和eIF2D在小鼠造血干祖細胞(HSPCs)中表達水平較高。

2.2 Met-tRNAiMet載體蛋白在健康人造血干細胞分化不同階段的表達

進一步利用健康人造血細胞的單細胞測序數據(GSE139369)[6]，分析不同階段造血細胞中Met-tRNAiMet載體蛋白的表達變化。用LSI(latent semantic indexing)[7]及UMAP(uniform manifold approximation and projection)[8]方法進行分析，發現eIF2A和eIF2D在HSPCs(包括HSC、CMP和LMPP)和紅系祖細胞(Early.Eryth)中表達水平較高(P<0.001)(圖2A～C,E～F)，而MCTS1在多種細胞群體中無明顯表達差異(圖2D, G)。

2.3 eIF2A和eIF2D在健康人和AML患者中具有表達差異

進一步探索上述Met-tRNAiMet載體蛋白在AML中的表達變化情況。利用參考文獻[9-10]中的數據集GSE13159分析健康人和AML患者單個核細胞中3個替代蛋白的表達水平，發現eIF2A和eIF2D在AML患者中表達顯著上調(P<0.001)(圖3A，B)，但MCTS1在健康人和AML患者中的表達無顯著差異(圖3C)。

eIF2A(A, D), eIF2D(B, E) and MCTS1(C, F) expression analyzed in RNA-seq data of mouse blood cells; Lt-HSC.long-term hematopoietic stem cell; St-HSC.short-term hematopoietic cell; MPP.multiple potential progenitor; CMP.common myeloid progenitor; MEP.megakaryocyte erythrocyte progenitor; GMP.granulocyte-macrophage progenitor; Erya and Eryb.erythrocyte A and erythrocyte B; mono.monocyte; CLP.common lymphoid progenitor; CD4.CD4+T cell; CD8.CD8+T cell; B.B cells; NK.natural killer;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with HSPCs group

2.4 eIF2A和eIF2D對AML細胞系增殖的影響

利用AML細胞系MOLM13進行eIF2A和eIF2D的功能研究。在MOLM13細胞系中，構建的兩條位點特異的shRNA均能顯著地在蛋白水平抑制eIF2A或eIF2D的表達(圖4A左，B左)，可用于后續功能實驗。抑制eIF2A或eIF2D的表達均導致MOLM13細胞增殖受阻(P<0.001)(圖4A右, B右)。

2.5 eIF2A和eIF2D對AML細胞系細胞周期的影響

抑制eIF2A或eIF2D的表達導致MOLM13細胞周期中處于G1期的細胞減少(P<0.01)，G2/M期的細胞增多(P<0.01)(圖4C,D)，即細胞在G2/M期發生阻滯。

2.6 AML細胞應激狀態下eIF2A和eIF2D表達上調

分別用salubrinal(10 μmol/L)處理和血清饑餓的方式處理細胞系MOLM13使細胞進入應激狀態。兩個應激組eIF2A和eIF2D的蛋白表達均上調(圖5)。

A.scRNA-seq LSI UMAP projection of 35882 single cells across healthy hematopoiesis;eIF2A(B,E), eIF2D(C,F) and MCTS1(D,G) expression analyzed in the biological classifications for the scRNA-seqclusters; *P<0.001 compared with mature group

3 討論

血細胞的生成依賴于HSCs獨一無二的自我更新能力和多譜系分化潛能，HSCs可分化生成所有血細胞[11]。AML是HSPCs發生的一種侵襲性克隆障礙，其具體表現為髓系干祖細胞分化受阻，并自我更新產生LSCs[12]。由于LSCs具有耐藥性，所以AML患者復發率高，5年存活率低。目前已報道的AML關鍵作用分子有很多，比如NPM1c[13]、RBM39[14]等，但尚未證實具有臨床治療效果，AML的研究成果仍然處于基礎研究水平，急需適用性更強的作用機制，找到AML治療的關鍵靶向分子。

eIF2A(A), eIF2D(B) and MCTS1(C) expression analyzed in GSE13159; *P<0.001 compared with normal group

cell proliferation(A, B right) and cell cycle(C)in MOLM13 cell line was analyzed after eIF2A(A left) or eIF2D(B left)knocked down; D.significant difference analysis of cell cycle; *P<0.01, **P<0.001 compared with plko.1 group

圖5 應激狀態下MOLM13細胞中eIF2A和 eIF2D的表達變化Fig 5 The changes of eIF2A and eIF2D expression in MOLM13 in stress

本研究證明，eIF2A和eIF2D在AML患者和正常HSPCs中高表達，提示eIF2A和eIF2D可能作為原癌基因在AML中發揮促癌作用。eIF2A和eIF2D的功能研究發現，eIF2A和eIF2D能夠促進MOLM13的增殖，并且能夠維持MOLM13細胞周期的正常進行。值得注意的是，本研究證實eIF2A和eIF2D能夠使MOLM13細胞正常經過細胞周期中的G2/M期，靶向抑制eIF2A或eIF2D表達后可使MOLM13阻滯在G2/M期。靶向G2/M期檢查點使腫瘤細胞長期阻滯在G2/M期可以作為腫瘤治療策略[15]。細胞應激狀態下eIF2A和eIF2D表達水平上調，提示eIF2A和eIF2D可能在eIF2不足的情況下通過轉運Met-tRNAiMet促進特定mRNA分子的翻譯。

綜上，eIF2A和eIF2D可能通過促使正常細胞周期的進行而增加MOLM13細胞的增殖能力，從而發揮原癌基因的功能；eIF2A和eIF2D有作為AML治療靶向分子的可能。