一例X-連鎖無丙種球蛋白血癥患者BTK基因新變異體的鑒定

張 晗，孫 陽，王蓉蓉，張 文，張 學*

(1.中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 麥庫西克-張孝騫協和遺傳醫學中心醫學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 風濕免疫科國家皮膚與免疫臨床醫學中心 衛生部重點實驗室，北京 100730)

先天性無丙種球蛋白血癥(congenital agammaglobulinemia)是一種罕見的原發性免疫缺陷病，其特征是血清免疫球蛋白水平低下和外周血B細胞缺乏。該病常呈X-連鎖隱性遺傳，但也有常染色體隱性遺傳和常染色體顯性遺傳形式的報道。其中BTK變異導致的X-連鎖無丙種球蛋白血癥(X-linked agammaglobulinemia, XLA; OMIM 300755)占先天性無丙種球蛋白血癥的85%。1952年Bruton最早報道XLA，故又被稱為Bruton病[1-2]。美國XLA患者登記的結果顯示，該病的最低發病率約為1/37.9萬例活產(1/19萬例男嬰)[3]。中國目前尚無XLA患病率或發病率的準確估計。XLA是由于位于Xq22.1上的Tec家族成員Bruton酪氨酸激酶(Bruton tyrosine kinase, BTK)基因發生變異導致的一種原發性體液免疫缺陷病，是典型的原發性B細胞缺陷病[4-6]。BTK基因變異會使得B細胞系發育障礙，血清免疫球蛋白合成不足，最終導致患者感染易感性增加[3, 7-8]。

本研究結合臨床表型、全外顯子組測序技術(whole exome sequencing, WES)、Sanger測序和實時定量PCR，通過相關基因診斷技術和遺傳學分析，對一例XLA患者進行研究，為該病的基因診斷、遺傳咨詢以及治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象:男性，31歲，由于3個月內反復發熱到北京協和醫院風濕免疫科就診。在獲得患者及其家庭成員的知情同意后，收集患者及其家系成員的臨床資料、家族史并對患者進行臨床診斷及家系分析(圖1)。該研究遵循赫爾辛基宣言(Helsinki Declaration)，并獲得中國醫學科學院基礎醫學研究所倫理委員會的審查批準(審批文號：015-2015)。

The square represents male, the circle represents female, the black symbol represents illness, the proband is indicated by an arrow圖1 X-連鎖無丙種球蛋白血癥家系圖譜Fig 1 Pedigree diagram of the family with X-linked agammaglobulinemia

1.1.2 試劑:DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)；引物合成(北京天一輝遠生物科技有限公司)Trizol試劑盒(Invitrogen公司)；反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本的采集與DNA的提取：留取患者及父母的外周血樣本并用全血細胞DNA提取試劑盒提取樣本基因組DNA。

1.2.2 WES測序篩選變異：取患者外周血基因組DNA 1 μg送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行WES檢測和數據分析，使用HiSeq 2500 PE125測序系統(美國Illumina公司)進行人類全外顯子組測序。并按照如下策略進行分析和篩選：1)按照遺傳方式關注呈X-連鎖遺傳和常染色體隱性遺傳的變異，不排除新生變異；2)選擇最小等位基因頻率≤0.001的變異；3)關注位于基因編碼區且改變所編碼蛋白質的變異及可能改變mRNA剪接的變異，如非同義變異、移碼變異和剪接位點變異；4)針對候選基因已報道的基因功能及軟件對變異的有害性進行預測，得到候選基因變異體；5)參考2015年美國醫學遺傳學和基因組學學會(ACMG) 針對序列變異解讀的標準和指南,對所得到變異的有害性進行分類，關注分類為致病、可疑致病和意義不明確的變異。

1.2.3 Sanger測序驗證：針對WES篩選出來的變異位點設計引物，從UCSC基因數據庫(http://genome.ucsc.edu/)獲取基因序列信息，利用Primer3 Input(version 4.1.0)(http://primer3.ut.ee/)進行在線設計引物，由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。PCR擴增患者及父母DNA樣本后，擴增產物送北京諾賽基因公司進行測序。

1.2.4 RNA的提取及cDNA測序：用Trizol試劑盒提取患者及其父親外周血中總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄2 μg RNA獲得cDNA。PCR擴增患者及其父親cDNA樣本后，擴增產物送北京諾賽基因公司進行測序。

1.2.5 實時定量PCR檢測mRNA：以β-Actin為內參，使用熒光定量PCR儀(QuantStudio?3 Real-Time PCR Instrument)檢測BTKmRNA的相對表達量。數據采用2-△△Ct法分析，具體方法為：△Ct=目標基因Ct均值-內參基因Ct均值，△△Ct=患者△Ct-健康對照△Ct。實時定量PCR實驗重復3次。

2 結果

2.1 臨床信息

患者(圖1)男性，31歲，因反復發熱、咳嗽就診。自訴自幼經常發熱，并伴有反復的上呼吸道感染及肺部感染，咳嗽、咳痰，否認痰中帶血。既往患有慢性支氣管炎。患者因無明顯誘因下經常出現腹痛、水樣便腹瀉被診斷為“慢性結腸炎”，否認便血。偶發雙膝關節疼痛。患者生長曲線正常。患者父母否認近親婚配史，患者否認其男性親屬有類似疾病。母親妊娠期間無異常。

2.2 實驗室檢查

患者血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG顯著降低，IgE大致正常。患者外周血淋巴細胞亞群分析顯示，外周血B淋巴細胞(CD19+)百分比為0，顯著降低。自然殺傷細胞(CD16+CD56+)百分比輕微降低，外周血T細胞(CD3+、CD4+、 CD8+、CD4+/ CD8+)正常。

2.3 WES測序結果分析和Sanger測序驗證

通過WES測序，總共得到10 G的數據量，平均深度>100*。通過上述分析流程，鑒定出患者在BTK(NM_000061)的3號內含子c.240+3A>C處有一變異，Sanger測序發現該變異來源于其母親，符合家系基因型-表型共分離(圖2)。該變異在dbSNP153數據庫、ExAC數據庫、gnomAD數據庫以及人類基因突變數據庫 (Human Gene Mutation Database, HGMD)中均未見報道。

圖2 患者及其父母BTK變異位點測序圖Fig 2 Sanger sequence chromatograms of the BTK variant in the patient and his parents

2.4 cDNA測序和mRNA定量檢測

cDNA測序顯示c.240+3A>C變異BTK3號內含子5′端106 bp堿基插入到BTK轉錄本第3號和第4號外顯子之間，引起閱讀框改變，終止密碼子提前出現(圖3)。實時定量PCR顯示，與無血緣關系正常男性(control)及其父親(Ⅰ-1)相比，患者(Ⅱ-1)BTK的mRNA表達水平明顯降低(圖4)。

3 討論

先天性無丙種球蛋白血癥是一種由于B細胞早期發育障礙所致的原發性免疫缺陷病，包括X-連鎖隱性遺傳、常染色體隱性遺傳和常染色體顯性遺傳。其中，XLA是一種由于B細胞早期發育障礙所致的原發性免疫缺陷病，呈X-連鎖隱性遺傳。患者多于6到12個月齡時起病，其最突出的臨床特征為早發、 反復的嚴重細菌感染[9]。XLA感染部位主要包括呼吸系統和消化系統，另外，還容易出現中耳炎、慢性鼻竇炎、皮肌炎等并發癥[6]。因該患者有反復的感染史，實驗室檢查結果顯示血清免疫球蛋白減少，外周血成熟B淋巴細胞缺如，懷疑其患有先天性無丙種球蛋白血癥，因此需對患者進行基因檢測輔助臨床診斷。

A.sanger sequence chromatograms of the BTK cDNA; B.schernatyc presentation dragram of BTK cDNA

The values presented are means of triplicate determinations，the control was set to 1.0，the Y-axis represented the relative expression of BTK, the results of the experiment were repeated three times圖4 患者及患者父親BTK相對表達量Fig 4 Relative mRNA expression of the BTK in the patient and his

BTK變異分析是XLA的診斷依據。BTK基因位于Xq22.1，長度為37 kb，包含有19個外顯子。該基因編碼的細胞質酪氨酸激酶蛋白(BTK)含有5個功能結構域，分別為PH、TH、SH2、SH3和TK[10-11]，已報道的變異主要包括錯義變異、無義變異、插入或缺失變異和剪接變異等，暫未發現突變熱點區域。其分子缺陷會導致B細胞系列發育障礙和功能障礙，從而導致免疫球蛋白缺乏和特異性抗體產生障礙[11-12]。本研究中患者攜帶c.240+3A>C變異，HGMD中未見報道，該突變導致來自3號內含子5′端的106 bp堿基插入到BTK轉錄本3號外顯子和4號外顯子之間，提前出現終止密碼子，mRNA發生降解，最終導致患者XLA疾病的發生。

BTK變異體檢測有助于XLA 早期診斷。全外顯子組測序技術的快速發展和廣泛應用，有助于BTK變異的鑒定。XLA如果不正規治療將會導致該病發病率和病死率激增[3]。早期診斷并給予有效治療有助于減少患者反復的細菌感染，避免嚴重并發癥的發生，改善患者的生存質量。自1952年Bruton成功地使用替代免疫球蛋白療法治療了第一例患者以來，免疫球蛋白替代療法一直是XLA的主要治療方法，目前有靜脈注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin, IVIG)途徑和皮下注射免疫球蛋白(subcutaneous immunoglobulin, SCIg)途徑兩種[1, 13-14]。

綜上所述，本研究結合患者臨床表型、實驗室檢查結果以及患者遺傳學檢測結果，鑒定了一個XLA的致病基因變異，為該患者的基因診斷、遺傳咨詢以及治療提供了依據;發現了BTKc.240+3A>C這一新的變異位點，豐富了BTK基因變異數據庫。