基于遺傳算法-神經網絡及響應面法優化龍牙百合總黃酮提取工藝

尹樂斌，鄧鵬，何平，劉椏麗，李樂樂

（1.邵陽學院食品與化學工程學院，湖南邵陽422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南邵陽422000）

龍牙百合（Lilium brownii）是一種屬于百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）的植物，為我國食藥用百合之一[1]，其鱗莖含有淀粉、維生素、皂苷、秋水仙堿和黃酮等成分，具有養陰潤肺、清心安神、美顏、抗疲勞與抗腫瘤等功效[2-6]。龍牙百合種植地主要分布在中國湖北、湖南等省份，其中僅湖南邵陽隆回縣龍牙百合的種植規模已達到2×107m2，產值達4 億元，已成為當地的特色產業[7]。龍牙百合亦藥亦食，極具開發利用價值，其鱗莖所含的黃酮類化合物是一類還原性物質，含量約為38.15 mg/g[8]。

黃酮類化合物在人體內可以發揮抗氧化的效果，進而達到延緩衰老和抑癌的作用，在注重健康生活的如今備受關注，因此提取龍牙百合黃酮成為目前的研究熱點之一。目前，關于優化龍牙百合提取黃酮的報道雖然較多[8-10]，但未見討論不同優化方法對提取結果的影響。常用的優化方法有正交設計、響應面設計與人工神經網絡（artificial neural network，ANN）等，幾種優化方式各有千秋，難分優劣。基于此，本文以龍牙百合粉為原料，乙醇為溶劑，在單因素試驗基礎上，探討Box-Behnken 設計響應面試驗（response surface methodology，RSM）和遺傳算法結合人工神經網絡（genetic algorithm-neural network，GA-NN）對龍牙百合總黃酮最佳提取工藝條件進行優化，研究結果為提高龍牙百合總黃酮利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

龍牙百合粉：市售；蘆丁標準品（色譜純）：萬物標準（北京）科技有限公司；硝酸鋁（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉（分析純）：天津永大化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：滄州滄龍化工產品有限公司。

DJ-A1000-電子天平：廣州市深華生物技術有限公司；SY-1210-恒溫水浴槽：武漢市梅宇儀器有限公司；VELOCITY-14R-離心機：Dynamica 公司；722-分光光度計：上海舜寧恒平科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

采用NaNO2-Al（NO3）3比色法進行蘆丁標準曲線的繪制與龍牙百合總黃酮的測定[7]。配制0.1 mg/mL 的蘆丁標準液：準確稱取10 mg 蘆丁，溶解于95%乙醇，并定容至100 mL。分別量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的0.1 mg/mL 蘆丁溶液放置于10 mL 的容量瓶中，然后依次加入質量分數5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻之后靜置6 min，再依次加入質量分數10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，靜置6 min，最后分別加入40 g/mL 的氫氧化鈉溶液2.0 mL，搖勻，用60%乙醇定容至刻度線，搖勻，靜置15 min，于510 nm 波長下測定其吸光度值，以蘆丁質量濃度為橫坐標（X）、吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2 龍牙百合總黃酮含量的計算

精確量取0.25 mL 樣品溶液于10 mL 容量瓶中，按1.2.1 方法測定吸光度，并按公式（1）計算總黃酮含量。

式中：X 為龍牙百合粉樣品總黃酮含量，mg/g；C為按蘆丁標準曲線方程計算出的黃酮濃度，mg/mL；V為龍牙百合粉黃酮提取液的體積，mL；N 為稀釋倍數；M 為稱取龍牙百合粉的質量，g。

1.2.3 單因素試驗

稱取1.25 g 干燥至恒重的龍牙百合粉末，分別考察提取時間、乙醇體積分數、液固比和提取溫度對總黃酮含量的影響。參數考察范圍分別為：提取時間15、30、45、60、75 min；乙醇體積分數40%、50%、60%、70%、80%；液固比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）；提取溫度30、40、50、60、70、80 ℃，離心（6 000 r/min，20 min）后收集上清液測定總黃酮。每組平行提取3 次。

1.2.4 RSM 試驗設計

基于單因素，采用Box-Behnken 設計原理進行的RSM 試驗，以提取時間、乙醇體積分數、液固比和提取溫度為條件，以總黃酮含量為響應值，進一步優化提取龍牙百合粉總黃酮的最佳條件。

1.2.5 ANN 模型構建

本研究將采用3 層的ANN 創建試驗因素的優化模型。選取提取時間、乙醇體積分數、液固比和提取溫度作為網絡4 個輸入層神經元，總黃酮含量作為輸出層節點見圖1。用“traingdm”作為訓練函數，以測試集均方誤差（mean square error，MSE）作為模型是否準確的指標，其主要是由學習效率、動量常數和隱含層神經元數決定。參考Winiczenko 等對ANN 參數優化方法，以學習效率、動量常數和隱含層神經元數為變量，MSE 為響應值，建立基于Box-Behnken 設計原理進行的RSM 試驗進行參數優化[11]。其中學習效率取值范圍為0.01～0.4，動量常數取值范圍為0.1～0.9。隱含層神經元，其數目通常使用經驗公式（2）計算得到，即所得的網絡結構為4-m-1 其中m 為隱含層節點數。

式中：m 為隱含層節點數；n 為輸入層節點數；l 為輸出層節點數；a 為[1，10]的常數。

圖1 醇提龍牙百合總黃酮的人工神經網絡模型Fig.1 Artificial neural networks of alcohol extraction of total flavonoids from Lilium brownii

1.2.6 虛擬樣本建立

虛擬樣本是基于試驗誤差所設置的樣本，在試驗過程中，往往會因為客觀因素導致自變量在設定水平上下浮動[12]。ANN 需要大量樣本進行訓練，故而引入虛擬樣本，且虛擬樣本可以加大訓練樣本密度，強化機器學習效果，致使在實際樣本的附近區域不會產生大的波動[13]。張紀興等、鐘旭美等在使用ANN 優化中使用虛擬樣本，所得測試結果相對誤差較小[12，14]。相反，王薇等與薛宏坤等未使用虛擬樣本，ANN 因樣本過少，測試結果相對誤差偏大[15-16]。因此本研究引入虛擬樣本，虛擬樣本的生成方法是在每個實際樣本的各變量增加一個±Δi 值，設定誤差范圍Δi=0.2%，根據L8（27）正交設計表，使每個實際樣本產生8 個虛擬樣本[17]。由此得到232 個虛擬樣本，加上29 個原樣本共261 個樣本參加訓練。第一個虛擬樣本設置見表1。

表1 虛擬樣本Table 1 Virtual samples

1.2.7 遺傳算法進行目標尋優

基于1.2.5 所構建的ANN 模型與遺傳優化算法（genetic algorithm，GA）結合對目標尋優，對RSM 結果及虛擬樣本進行全面仿真試驗，擬合得到總黃酮含量最大的值，并反饋出其對應的條件，即優化后的工藝參數。設定種群大小為50，最大進化代數為150，交叉概率0.2，變異概率為0.05，代溝0.9，運行Matlab 軟件程序，得到每代種群平均適應度變化結果。

1.2.8 RSM 與GA-NN 預測結果對比

參考文獻[15]與[18]，以均方根誤差（root mean square error，RMSE）、平均絕對百分比誤差（mean abso lute percent error，MAPE）和決定系數（R2）大小作為評價預測提取總黃酮含量模型的指標，其中RMSE 和MAPE越低，R2越高，則表示構建的模型越穩定越優秀。

1.3 數據處理

采用SPSS 軟件分析每組試驗數據方差；Design-Expert ver8.0.6 軟件設計并分析RSM；Matlab R2016a構建GA-NN 模型；Excel 分析結果誤差；Origin 7.5 制作數據圖形。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

以蘆丁質量濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線，線性擬合方程為Y=7.822 6X+0.020 8（R2=0.995 9）。結果顯示蘆丁標準溶液0～0.07 mg/mL內與吸光度的線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果分析

單因素試驗中，乙醇體積分數、提取溫度、液固比和提取時間對總黃酮含量的影響見圖2。

由圖2A 可知，在提取時間15 min～75 min 范圍內，總黃酮含量先快速上升，達到極值后緩慢下降，當提取時間為45 min 時，百合總黃酮含量最大。在提取時間為15 min～45 min 時，溶液中總黃酮含量變化上升明顯，因為在這段時間內胞內外總黃酮濃度差極大，溶液中總黃酮溶出遠大于分解速率。在45 min～60 min 之間，溶液中總黃酮含量呈現不明顯的下降，這是因為隨著總黃酮不斷溶出，胞內外總黃酮濃度趨于平衡，溶出速率降低，并且由于溶液中總黃酮含量的上升，被分解的總黃酮也在增多，導致總黃酮溶出速率開始小于分解速率，但總體仍趨于平衡[19-20]。60 min 后，溶液中總黃酮含量呈現出顯著下降，這是因為隨著胞內總黃酮不斷減少，溶出速率明顯低于分解速率。故提取時間最佳點為45 min。

圖2 單因素試驗結果Fig.2 Results of single factor experiments

總黃酮含量在乙醇體積分數40%～80%范圍的變化如圖2B 所示，總黃酮含量先上升后下降，乙醇體積分數為50%時，百合總黃酮含量最大，繼而隨著濃度增大總黃酮含量呈現下降。這是因為NaNO2-Al（NO3）3比色法顯色原理是發生在黃酮醇類成分鄰位無取代的鄰二酚羥基部位[21]。而黃酮醇類是平面結構，水溶性較差，在水-乙醇混合體系中溶解效果較好，與溶劑的極性有一定的關聯。龍牙百合粉胞內黃酮極性與乙醇體積分數為50%時的水溶液極性較為相似，乙醇體積分數由40%上升至50%時，溶液中總黃酮含量上升明顯，50%到60%時，則呈現出不顯著的下降，這與李化強等結果較為相似[10]。并且在乙醇體積分數為50%時，該體系下的水與乙醇混合液會使得百合細胞溶脹性變大，溶劑能更好的向百合細胞內部滲透，總黃酮溶出量也會因此增加[22]。當乙醇體積分數由60%上升至80%時，溶液中總黃酮呈現顯著下降，這是因為溶液極性與黃酮醇極性差距變大，因此導致其溶解性逐漸降低，并且伴隨著其余醇溶性物質的溶出與黃酮醇形成競爭關系，使總黃酮得率下降[23]。因此，最佳乙醇體積分數為50%。

由圖2C 可知，總黃酮含量呈現先上升后下降趨勢。在液固比由20∶1（mL/g）上升至40∶1（mL/g）時，總黃酮含量呈現出顯著上升，這是因為在較低液固比的情況下，溶劑的體積過少，百合粉未能與溶劑充分混和，較多細胞未分散于溶劑中，接觸面積較低，胞內黃酮未能完全提取出來。隨著液固比增大，粉末逐漸與溶劑混合充分，細胞充分分散于溶劑中，接觸面積因此上升，有利于黃酮溶出，其含量亦逐漸增加。當液固比處于40∶1（mL/g）～60∶1（mL/g）時，溶液中總黃酮含量由緩慢下降變為明顯下降，因為溶劑體積增加導致總黃酮分散，而分散的黃酮容易發生變性分解，另一方面溶出的總黃酮總量增率不及溶劑體積增率大，因此總黃酮含量被稀釋，造成提取總量雖然增加，但濃度卻是下降[24-25]。為了減少溶劑不必要的浪費，所以將最佳液固比控制為40∶1（mL/g）。

如圖2D 所示，當提取溫度在40 ℃升至70 ℃的過程中，總黃酮含量呈現出明顯的上升趨勢，這是因為隨著溫度上升，溶液中分子運動速率也得以上升，溶劑在粉末表面流速與壓強都得到明顯提升，胞內外物質交換更加頻繁，總黃酮溶出速率因此得到增加。當溫度升高到80 ℃時，總黃酮含量則呈現緩慢下降，這可能是較高溫度下，乙醇開始揮發，溶劑極性開始變化，黃酮溶出速率發生改變。同時，在較高溫度的情況下，物質溶出速率雖然會增加，但是不穩定物質的分解速率亦加快[26]。Chaaban 等在考察6 種不同黃酮類化合物的熱穩定性，得出黃酮和黃酮醇在70 ℃～80 ℃降解速率明顯加快[27]，因此在提取溫度為80℃的情況下，黃酮分解速率在提取結束前就已占主導[28-29]，因此，本研究的后續試驗提取溫度設為70 ℃。

2.3 RSM 優化提取龍牙百合總黃酮工藝

2.3.1 建立模型與分析

在單因素試驗基礎上，以提取時間（A）、乙醇體積分數（B）、液固比（C）和提取時間（D）為考察因素，以總黃酮含量為響應值，設計四因素三水平RSM 試驗，對工藝條件進行進一步優化，因素水平、設計結果、方差分析見表2～表4。

表2 響應面試驗因素水平Table 2 Level of experimental factors

表3 Box-Behnken 試驗設計和結果Table 3 Box-Behnken designs and results

Design-Expert 8.0.6 軟件對表3 的試驗數據進行分析，得到百合總黃酮含量的編碼值回歸模型方程，Y=44.95+0.85A+2.05B+0.48C+1.09D-0.02AB+0.96AC-0.81AD +0.43BC -0.16BD -0.47CD -1.49A2-1.54B2-1.03C2-1.53D2。從表4 中各一次項的F 值可以判斷出，各因素對總黃酮含量的影響排序為乙醇體積分數＞提取溫度＞提取時間＞液固比。模型的F 值為21.54，P＜0.000 1，極顯著，說明該模型有統計學意義。失擬項F值為3.01，P=0.149 9＞0.05，表現為不顯著，即方程的擬合度較好。表明可以使用該方程確定龍牙百合總黃酮最佳提取工藝。

表4 響應面多項式模型的方差分析Table 4 ANOVA for response surface polynomial model

2.3.2 各因素間的交互作用分析

RSM 的3D 圖和等高線能夠較為直觀的體現出各個因素的交互作用對響應值的影響[30]。其中曲面圖開口向下表示響應值有極大值。等高線形狀則反映了交互作用顯著程度的強弱，顯著程度與橢圓的離心率呈正相關。不同因素對龍牙百合總黃酮含量的響應面見圖3。

由圖3 可知，不同交互因素之間均存在穩定的極值，交互因素AC、AD 的等高線呈現橢圓，且響應曲面圖坡度較陡，表明所對應的因素之間的交互作用較為明顯。

2.3.3 優化結果與驗證試驗

百合總黃酮的提取最佳工藝經Design-Expert 8.0.6 軟件分析得出：提取時間51.44 min、乙醇體積分數57.35%、液固比45.60 ∶1（mL/g）和 提取溫度71.19 ℃，在此條件下提取的龍牙百合總黃酮預測含量為46.08 mg/g。對RSM 優化結果進行驗證試驗。根據生產實際最佳工藝參數進行調整，提取時間51 min、乙醇體積分數57%、液固比46∶1（mL/g）、提取溫度71 ℃，在此條件下進行龍牙百合醇提總黃酮的驗證試驗（n=3），得到的百合總黃酮實際含量為46.63 mg/g，試驗值比理論值大1.19%＜0.05，與理論預測值差異不顯著，即RSM 優化預測的最佳工藝條件準確可靠，可以用于預測龍牙百合總黃酮提取含量。

2.4 ANN 模型構建結果

決定ANN 模型的穩健性的參數分別為：學習效率、動量參數與隱含層神經元數。其中隱含層神經元數m 由公式與其實際意義，得取值范圍為[3，13]，設定ANN 訓練循環次數為10 000，訓練誤差目標為0.000 01，使用Box-Behnken 設計原理進行的RSM 試驗，對測試集MSE 尋找最小值，得學習效率、動量參數與隱含層神經元數分別為10、0.31 和0.48。確定網絡拓撲結構為4-10-1，根據上述結果，并對試驗數據與虛擬樣本進行訓練，對應的網絡訓練模型適配，訓練集、驗證集、測試集和全部數據集見圖4，擬合結果相關系數均達到0.99，表明建立的ANN 模型性能極好，準確性高。

圖4 訓練模型適配Fig.4 Training model adaptation

2.5 利用GA 優化及驗證總黃酮提取工藝結果

將表3 中RSM 結果及其虛擬數組作為初始群體，通過ANN 模型調試函數的適應度，以龍牙百合總黃酮含量作為其函數的輸出值，將ANN 和GA 結合對提取工藝進行全局尋優，獲得最佳的龍牙百合提取總黃酮的工藝。運行相關程序后，得GA 尋優結果如圖5所示。

圖5 適應度曲線Fig.5 Fitness curve

由圖5 可得，經過36 代后達到最佳適應度，此后適應度曲線平穩，表明提取的總黃酮含量已達到最大值，之后基本保持不變，經GA-NN 對提取工藝進行全局尋優，獲得提取龍牙百合總黃酮含量最大預測值為46.83mg/g，對應的工藝條件分別為：提取時間50.04 min、乙醇體積分數53.37%、液固比43.37∶1（mL/g）、提取溫度73.39 ℃。在修正后：提取時間50 min、乙醇體積分數53%、液固比43∶1（mL/g）、提取溫度73 ℃條件下進行驗證試驗（n=3），得總黃酮提取含量為47.17mg/g，試驗值比理論值大0.72%＜0.05，與理論預測值差異不顯著，且高于RSM 的優化值。

2.6 RSM 與GA-NN 預測結果對比

結合表3 RSM 和GA-NN 模型所提供的總黃酮含量預測值。使用Excel 分別計算出RSM 和GA-NN的RMSE、MAPE、R2值，分別為0.435 5、0.858%、0.955 4和0.149 7、0.103 7%、0.994 7。其中RSM 和GA-NN 模型的預測值統計評估結果如圖6 所示。從RMSE、MAPE、R2值的對比中，可以得出結論，GA-NN 模型比RSM 模型具有更加精準的擬合度和估計預測能力。

2.7 RSM 與GA-NN 優化結果對比

RSM 與GA-NN 優化各項參數、預測值、實際值以及相對誤差的對比見表5。

圖6 模型預測值與實際值的對比Fig.6 Comparison of model predicted value and actual value

表5 優化結果比較Table 5 Comparison of optimization results

由表5 可知，GA-NN 優化的相對誤差明顯低于RSM 優化的相對誤差，且GA-NN 優化結果高于RSM優化方法，表明GA-NN 優化結果更加可信，證明用該方法進行優化醇提龍牙百合中的總黃酮是可行的。

3 結論與討論

探討醇提龍牙百合黃酮的文獻較多[8-10]，但多為正交試驗優化。正交試驗僅從所進行的試驗點中尋找最優值，因此，所得的結果可能與實際上的最優值相差甚遠，與正交試驗相比，基于Box-Behnken 原理建立的RSM 試驗是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值的函數關系，其建模與尋優能力在正交設計之上，但極度依賴于所得的方程，且忽略了多項式階數的影響，因此在高階多項式影響情況較大的時候，就會導致相對偏差過大的現象，難以找出準確的區域面[31-32]。ANN 是通過構建數據正向傳播和誤差的負向反饋的循環，將輸出值與期望輸出值之間的誤差平方和降到最低的方法，GA 則是一種通過模擬自然界生物自適應過程的算法，采用物競天擇的規則，通過適應度來評估個體的生存能力，使得其中優秀個體得以保留，遺傳至下一代，直到迭代結束[33]。ANN 結合GA 是將均方誤差函數作為適應度函數，將兩者的評估標準融為一體，可以提高網絡優化性能。該法優化不依賴于一個明確的函數表達式，ANN 通過局部尋優可以減少GA 的搜索空間、提高搜索效率；GA 則反復優化網絡的權值，直到平均值不再顯著增加為止。此時解碼得到的參數組合已經充分接近最佳，再用ANN 尋優，搜索出最優解。該法具有優秀的非線性模擬能力和非魯棒性，并且建模與尋優過程可以利用數據可視化技術以直觀的圖表展現出來[34-35]。

中藥的化學成分具有多樣性、復雜性，提取亦是非線性的擬合過程，基于二次回歸方程的預測顯示了模擬結果的R2為0.9554，表明模擬效果較為準確。GANN 采用的全局性的非線性擬合，其模擬結果的R2高達0.994 7，表明其建模能力比RSM 建模能力更加優秀。這也說明醇提龍牙百合總黃酮含量的非線性較強，RSM 擬合效果不如GA-NN，這與ANN 在其它方面的應用結果相吻合[36-38]。盡管本文GA-NN 優化結果僅比RSM 結果值大1.15%，優化結果并不顯著，但依舊表明該法具有可行性。因為GA-NN 在優化過程中并不需要增加額外試驗，方法較為簡單，這與MOZAMMEL等、SALILA 等和DHUPAL 等[39-41]試驗方法類似，都是在RSM 的試驗數據上進行優化，將RSM 作為GA-NN目標函數的粗糙二階模型，最終均在優化中取得了較好的結果。在模型的預測結果對比中可知，GA-NN 的RMSE、MAPE 值均低于RSM，因此可以認為GA-NN已對RSM 的二階模型進一步優化。因此最終采用GA-NN 優化得到龍牙百合粉醇提總黃酮的最佳工藝條件：提取時間50 min、乙醇體積分數53%、液固比43∶1（mL/g）、提取溫度73 ℃。該條件下得總黃酮含量為47.17 mg/g。表明，GA-NN 能夠優化提取工藝，具有較好的成效，且在解決非線性較強模型的建立及模型參數的優化問題上有相應的優勢，可作進一步研究。