大黃提取物灌胃對腦梗死大鼠血腦屏障通透性的改善作用及其機制

王飛，劉建雄 ，王明明，喬櫟

1 甘肅中醫藥大學，甘肅蘭州730030；2 甘肅省人民醫院

腦卒中是目前致殘率和致死率最高的疾病之一，其臨床上可分為缺血性和出血性。腦梗死是腦缺血卒中疾病，占全部腦血管病的70%，其致殘率可達50%～70%［1］，存活者40%可復發，卒中復發頻率與病死率和致殘率呈正相關。研究［2］顯示，血腦屏障（BBB）由排列在腦毛細血管上的內皮細胞組成，腦梗死后BBB 的破壞及其滲透升高是由炎癥反應、氧化應激物的生成、基質金屬蛋白酶-9 的激活等一個復雜過程形成的。研究［3-6］顯示，大黃能清除氧自由基、降低血管通透性、減少腦組織損害，有鈣離子拮抗等作用，而且大黃能降低腦梗死大鼠腦組織中NF-κB 和細胞間黏附分子-1 等炎癥因子，可改善BBB損傷和減輕腦水腫。BBB結構與功能的基礎是腦微血管內皮細胞之間的緊密連接，由閉鎖蛋白（Occludin）、claudin 蛋白和連接黏附分子（JAMs）構成，其中Occludin 是BBB 緊密連接中最重要的蛋白［7-10］。研究［11］顯示，Occludin 在腦內皮細胞高表達，而在非神經內皮細胞中低表達，對BBB 的通透性起著重要的調節作用。近年對于Occludin的研究主要集中在腦腫瘤、腦出血、多發性硬化等方面［12］，關于腦梗死的研究很少。2019 年12 月2 日—2020年9 月14 日，本研究觀察了大黃提取物灌胃對腦梗死大鼠BBB的保護作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 大鼠分組、腦梗死模型的建立及大黃提取物給予方法 選取甘肅中醫藥大學動物實驗室提供的SPF 級 SD 雄性大鼠 180 只，體質量 250～280 g。SD大鼠按需進食及飲水，飼養環境相同，喂養1周適應后用于動物實驗。將180 只大鼠隨機分為假手術組、模型組、大黃組，每組60 只。模型組和大黃組大鼠采用經典longa＇s 線拴法制備腦梗死模型［13］。大鼠腦梗死模型建立成功的特點是上肢屈曲，行走時向左旋轉，清醒時左側肢體癱瘓。假手術組大鼠頸總動脈與頸內、頸外動脈分離后，不結扎大腦中動脈。成功建立動物模型后，每天上午9：00 和下午 17：00 分別給大鼠灌胃，大黃組給予2.5 mL 大黃提取物灌胃，假手術組、模型組給予2.5 mL 生理鹽水灌胃。各組在建模后第1、3、5、7、10 天隨機設置5 個時間點，每個時間點取10 只大鼠用于實驗研究。本研究經甘肅中醫藥大學醫學倫理委員會批準。

1.2 各組大鼠神經功能評分 采用Longa 評分法［13］，對各組大鼠進行神經功能評分。無神經功能缺損記0 分，左前爪不能完全伸展記1 分，行走時轉向左側障礙記2 分，行走時向左側傾倒記3 分，無法行走或失去意識記4分，死亡記5分。

1.3 各組大鼠腦組織中伊文思藍（EB）滲出量測算 建模后第 1、3、5、7、10 天隨機選擇5 只大鼠，在處死前30 min 通過尾靜脈靜脈注射2% EB（2 mL/kg），處死后用甲酰胺浸泡法［14］測算大鼠腦組織中EB滲出量。

1.4 各組大鼠腦梗死區Occludin mRNA 檢測 采用 Real-time PCR 法。建模后第 1、3、5、7、10 天隨機選擇5 只大鼠，通過快速斷頭和開顱手術獲得腦組織，將腦組織置于用DEPC 處理的培養皿上，分離右腦組織，取腦梗死區100 mg 腦髓質放入冷凍保存管中，浸入液氮后?80 ℃儲存。取大鼠腦梗死區組織，TRIzol 法提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書步驟逆轉錄為 cDNA，以 β-actin 為內參，進行 PCR 反應。引物序列如下：Occludin 正向引物為5′-ACG?GTGCCATAGAATGAGATGTTG-3′，反向引物為5′-CAGCTAGTTGTTCATTTCTGCACCA-3′；β -actin 正向引物為 5′-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3′，反向引 物 為 5′-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。 Realtime PCR 反應體系：熒光染料 10 μL，cDNA 產物2 μL，10 μmol／L 目的基因引物各1 μL，DEPC 處理雙蒸水 6 μL，共 20 μL。以 2?ΔΔCt表示大鼠腦梗死區Occludin mRNA的相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料以表示，比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較 各組大鼠神經功能評分比較見表1，由表1 可知，假手術組大鼠神經功能評分均為0分，神經功能未受損傷；模型組大鼠第1 天神經功能評分明顯升高，第3 天達峰值，第5 天開始下降；大黃組大鼠每個時間點的神經功能評分均低于模型組（P均＜0.05）。

表1 各組大鼠神經功能評分比較（分，）

表1 各組大鼠神經功能評分比較（分，）

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術組模型組大黃組神經功能評分第10天0 2.01±0.79*1.01±0.12*#第1天0 1.98±0.31*1.53±0.18*#第3天0 2.41±0.28*1.74±0.20*#第5天0 2.35±0.11*1.49±0.14*#第7天0 2.13±0.21*1.37±0.09*#

2.2 各組大鼠腦組織中EB滲出量比較 各組大鼠腦組織中EB滲出量比較見表2。由表2可知，假手術組大鼠腦組織中EB滲出量較少，且各時間點無變化；模型組大鼠第1天腦組織中EB滲出量明顯升高，第3天達峰值，第5天開始下降；大黃組大鼠每個時間點的腦組織中EB滲出量均低于模型組（P均＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織中EB滲出量比較（%，）

表2 各組大鼠腦組織中EB滲出量比較（%，）

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別腦組織中EB滲出量第1天0.95±0.12 2.75±0.10*2.57±0.22*#第5天0.93±0.09 2.44±0.30*2.12±0.09*#第10天0.94±0.12 1.99±0.15*1.74±0.15*#第3天0.94±0.13 3.31±0.14*2.30±0.15*#第7天0.95±0.10 2.23±0.21*1.93±0.10*#假手術組模型組大黃組

2.3 各組大鼠腦梗死區Occludin mRNA 相對表達量比較 各組大鼠腦梗死區Occludin mRNA相對表達量比較見表3。由表3 可知，假手術組大鼠腦梗死區Occludin mRNA 相對表達量在各時間點無明顯變化趨勢；模型組大鼠第1 天腦梗死區Occludin mRNA 相對表達量開始下降，第3 天最低，第5 天后開始升高，第10 天時接近假手術組；大黃組大鼠每個時間點的腦梗死區Oc?cludin mRNA 相對表達量均高于模型組（P均＜0.05）。

表3 各組大鼠腦梗死區Occludin mRNA 相對表達量（）

表3 各組大鼠腦梗死區Occludin mRNA 相對表達量（）

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術組模型組大黃組腦梗死區Occludin mRNA相對表達量第10天0.89±0.17 0.75±0.19*0.83±0.12*#第1天0.89±0.10 0.32±0.03*0.43±0.11*#第3天0.90±0.23 0.28±0.10*0.59±0.14*#第5天0.86±0.06 0.43±0.13*0.68±0.13*#第7天0.88±0.04 0.53±0.04*0.71±0.11*#

3 討論

腦梗死是由于多種原因導致局部動脈血流減少或停止，致使供血區的腦組織缺血、缺氧的狀態，導致后期出現肢體偏癱、失語等神經功能缺損的癥狀［1］。BBB 結構與功能的基礎是腦微血管內皮細胞之間的緊密連接［15］，由Occludin、claudin 蛋白和連接黏附分子構成，各種內源、外源的信號通路通過調節這些蛋白達到對BBB 通透性的調節。生大黃的主要成分是蒽醌衍生物［5～6］，其主要功能是解熱、洗胃、活血化瘀。研究［16］顯示，大黃可以抑制線粒體凋亡，從而抵抗缺氧所致的大鼠海馬組織的損傷；同時可以通過下調HIF-1α 減輕腦缺血缺氧的損傷范圍，使得加速梗死區神經細胞的恢復。在本研究過程中，模型組大鼠神經功能評分趨勢是：第1 天大鼠神經功能評分明顯升高，第3 天時達峰值，第5 天評分下降，第10天時最低。在每個時間點大黃治療腦梗死后的神經功能評分均顯著低于模型組，說明大黃可以使小鼠的神經功能損傷程度得到有效地改善。我們分析認為，這可能與大黃可以抑制腦組織線粒體的凋亡，從而減少缺氧所致的腦梗死損傷以及加速神經細胞的恢復有關，這說明大黃對于腦梗死后神經損傷減輕和神經功能的恢復有顯著作用。

研究［17］發現，在缺血性腦卒中再灌注發生后致APT能量不足并使作為BBB基礎結構的血管內皮的肌動蛋白聚合、肌球蛋白磷酸化，產生肌動蛋白收縮，細胞結構受損，則BBB 的通透性增加。在缺血性腦卒中患者腦組織中，氧化應激產物活性氧簇增加致使內皮細胞受損，細胞因子可直接致使緊密連接蛋白 Claudin-5 及 Occludin 降解，IL-6 激活 NF-κB增加細胞黏附因子，可增強外周白細胞通過BBB 損傷部位從而增加入侵的能力。腦卒中患者嚴重者處于絕對臥床休息時，其胃腸道處于抑制狀態，致使腸道內毒素吸收增加，腦內的內毒素亦增加。研究［18］顯示，大黃有腸道瀉下的作用，可排空胃腸道、改善腦組織缺血缺氧的狀態，同時也可以修復胃黏膜，減輕應激性消化道潰瘍。腦組織的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷可以通過血腦積液屏障進入，可以抑制大鼠皮質細胞釋放乳酸脫氫酶，降低線粒體的活性，直接發揮對腦組織的保護作用。大黃及大黃制劑的有效成分可抑制大鼠細胞外鈣離子內流，抑制血小板聚集，能提高腦缺血再灌注大鼠血清一氧化氮含量和腦組織一氧化氮合酶活性，降低腦組織含量，改善腦組織損傷；大黃注射液能顯著改善花生四烯酸誘導的腦缺血大鼠血液流變學，降低血小板聚集，抑制血栓素A 合成，降低血栓素A/前列腺素比值，減輕腦水腫，降低死亡率。本研究發現，腦梗死后第1天Occludin mRNA 相對表達量明顯下調，第3天表達最低，第5 天開始明顯升高，但大黃組的Occludin mRNA 較模型組的各個時間點均增加；同時比較腦組織中EB 滲出量，發現模型組大鼠第1 天腦組織中EB 滲出量明顯升高，第3 天達峰值，第5 天開始下降；大黃組大鼠每個時間點的腦組織中EB滲出量均低于模型組，說明腦梗死后由于炎性因子和凝血酶破壞BBB，使Occludin mRNA 發生酪氨酸磷酸化導致表達降低，同時BBB 受損導致EB 滲出增加，但大黃可阻止內皮細胞受損，降低Occludin mRNA 的分解，減輕BBB 受損。同時，由于缺血缺氧，緊密連接蛋白表達降低，BBB 通透性與Occludin mRNA 表達趨勢相反，這可能與大黃素通過BBB 進入細胞內降低線粒體的活性，直接對腦組織缺氧產生保護作用，并通過改變血流動力學減輕腦水腫有關。

綜上所述，大黃提取物灌胃可改善腦梗死大鼠的BBB 通透性，其機制可能與大黃提取物阻止腦梗死區Occludinm mRNA 的降解有關。本研究揭示了大黃灌胃對腦梗死大鼠BBB 的保護作用，可以為腦梗死的臨床治療提供新的實驗支持和理論依據。