銀杏葉提取物對TGF-β1誘導增殖的SD乳鼠心肌成纖維細胞生長抑制作用及其機制

胡方芳，易鮫隆，王順，成榮，李偉，羅振華

1 貴州省人民醫院，貴州貴陽550001；2 貴州醫科大學附屬醫院

心肌纖維化（MF）是各種因素如高血壓、冠心病、心肌病等所致心肌細胞缺血、缺氧及壞死，心肌成纖維細胞（CFb）異常增殖，胞外基質沉積的重塑過程，MF可導致心肌的硬度增加、順應性降低、舒縮功能下降，是慢性心力衰竭、心源性猝死的影響因素之一［1］。同時，MF 還會使心電信號傳導受阻，誘發心律失常。因此，研究具有改善MF 病變功能的藥物對于改善心臟功能及預防慢性心力衰竭的發生具有重要意義。TGF-β1-samd/TAK1 信號通路是MF的關鍵信號通路［2-4］，其可通過MMP/TIMP 調節膠原蛋白的降解。另一方面，TGF-β1-samd/TAK1 信號通路還可以通過結締組織生長因子（CTGF）和相關microRNA 調節膠原蛋白的合成。銀杏葉提取物（GBE）是以銀杏葉為原料，通過加工提取得到的有效成分。研究［5］發現，GBE 有清除自由基、抗氧化、改善血液流變學、抗血小板聚集和防治動脈粥樣硬化等作用。同時研究［6］發現，經GBE 治療后Ⅰ型糖尿病模型大鼠的心室心肌內血糖、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原、TGF-β1 的表達水平均明顯降低，推測GBE 可通過下調TGF-β1基因表達，減少Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原的合成，進而抑制Ⅰ型糖尿病心肌病大鼠MF，改善心臟功能。2018 年 1 月—2019 年 6 月，我們觀察了GBE對TGF-β1誘導增殖的SD乳鼠CFb的生長抑制作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 動物、GBE、試劑及儀器 清潔級雄性SD 大鼠，210～260 g，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，飼養于貴州醫科大學清潔級實驗動物房。培養環境溫度、濕度均恒定。SD 雌鼠與雄鼠按照3∶1 的比例共圈飼養，取出生1～3 d的SD乳鼠作為實驗用鼠。GBE 由中國藥品生物制品鑒定所提供，其成分及含量符合國家藥品純度標準。Anti-Vimentin anti?body 購自美國 Proteintech 公司，Anti-Actin antibody、ALK5抑制劑SB-431542購自美國ImmunoWay公司，TGF-β1 購自美國 Pepro tech 公司，通用型二抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司。CX23 光學顯微鏡、IX71 倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS 公司，CFX Connect QPCR 儀、凝膠成像儀購自美國BioRAD 公司，核酸分析儀購自Thermo公司。

1.2 CFb 細胞提取、分組及GBE 給予 取出生1～3 d 的SD 乳鼠心臟［7］進行原代細胞的培養及傳代培養，取2～3 代生長密度達到80%融合的CFb 分為 4 組，其中 TGF-β1 組加入 20 ng/mL 的 TGF-β1 溶液，低濃度 GBE 組加入 20 ng/mL 的 TGF-β1 溶液和2 μg/mL的GBE溶液，高濃度GBE組加入20 ng/mL的TGF-β1 溶液和 20 μg/mL 的 GBE 溶液，對照組加入等量含10%胎牛血清的DMEM。

1.3 各組細胞增殖率測算 采用MTT 比色法。取各組細胞，繼續培養48 h，加入濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL，繼續培養4 h，吸凈上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min，使用酶標儀測定各孔波長為490 nm 處的光密度值（OD 值），計算各組細胞增殖率。各組細胞增殖率=各組OD 值/對照組OD值×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.4 各組細胞結締組織生長因子（CTGF）、氨基末端激酶（JNK）、P38 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）法。取各組細胞，繼續培養48 h 后，TRIzol 法提取 RNA，反轉錄成 cDNA，以 cDNA 為模板、以 β-Actin 為內參進行 PCR 擴增。PCR 反應條件：95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性 30 s，60 ℃退火 5 s，40 個循環。引物序列如下：JNK 上游引物為5′-AA?CAGCTCGGAACACCTTGT-3′，下游引物為5′-GAT?GTACGGGTGCTGGAGAG-3′；CTGF 上游引物為 5′-AATGCTGT TGAGGAGTGGGTG-3′，下游引物為5′-ACAGGTCTTAGAACAGCCGC-3′；P38 上游引物為5′-ACCTAAAGCCCAGCAACCTC-3′，下游引物為5′-AGCCCACGGACCAAATATCC-3′。以2-ΔCt表示細胞中目的基因mRNA的相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料以表示，各實驗組間結果均數比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖率比較 TGF-β1 組、低濃度GBE 組、高濃度GBE 組、對照組細胞增殖率分別為124.1% ± 13.4%、106.1% ± 7.5%、83.5% ± 5.2%、100.0%，其中TGF-β1組與對照組、高濃度GBE組相比，P均＜0.05。

2.2 各組細胞CTGF、JNK、P38 mRNA 相對表達量比較 各組細胞CTGF、JNK、P38 mRNA相對表達量比較見表1。

3 討論

急性心肌梗死（AMI）嚴重威脅人類健康，介入治療和藥物溶栓的應用極大降低了急性心肌梗死患者的死亡率，但其后期形成的心肌重塑可導致充血性心力衰竭、致死性心律失常等惡性轉歸，是造成惡性心律失常和猝死的主要病理原因，因此延緩或逆轉心肌纖維化是防治心肌梗死后心肌重塑的關鍵。

表1 各組細胞CTGF、JNK、P38 mRNA相對表達量比較（）

表1 各組細胞CTGF、JNK、P38 mRNA相對表達量比較（）

注：與對照組相比，▲P＜0.05；與TGF-β1組相比，△P＜0.01。

組別TGF-β1組低濃度GBE組高濃度GBE組對照組P38 mRNA 1.40±0.04▲0.61± 0.23▲△0.63± 0.24▲△1.00±0.00 CTGF mRNA 1.42±0.08▲0.76±0.03 0.64± 0.06▲△1.00±0.02 JNK mRNA 1.28±0.07▲0.51±0.09 0.37±0.14▲△1.00±0.10

GBE 為傳統中藥銀杏葉的主要效應活性物質，含有200 多種藥用成分，主要活性成分是銀杏黃酮和銀杏內酯類化合物［8-9］。GBE 在降血脂、張擴血管、抗炎、抗過敏、清除自由基、保護心腦血管、降低血清膽固醇等方面發揮藥效［10］，在改善心力衰竭、減輕腦梗死面積、營養糖尿病周圍神經病變、降低肺動脈高壓及肺纖維化等多種疾病治療中起到廣泛作用。研究［11-13］發現，GBE 能夠對 AMI 繼發心肌重塑具有顯著的保護作用，并能夠改善CFb 病變對繼發心肌重構細胞外基質病變相關蛋白以及膠原蛋白表達水平產生影響，同時GBE 的活性與其對TGF-β1-samd/TAK1 信號通路的調控有關。TGF-β1 導致心臟纖維化的相關實驗研究主要局限在TGF-β1-samd/TAK1 細胞上游信號通路，但對下游信號通路具體調控MF 的分子作用機制仍然研究得較少，與劑量是否有關目前也尚未報道。

在組織纖維化過程中，TGF-β1-samd/TAK1 細胞信號通路是已知最重要的通路之一。samd 作為信號通路的上游信號蛋白因子，在被TGF-β1 激活后，活化CTGF、P38-MAPK、JNK-MAPK 下游信號通路，從而引起乳鼠炎癥因子增加、心臟肥厚、間質纖維化、嚴重的心功能不全、心肌凋亡甚至死亡。CT?GF 是近年來發現的一種新的致纖維化的因子，為TGF-β1 的下游效應因子，CTGF 可接受多種細胞因子刺激［14-16］，如RAS 系統、氧化應激、炎性因子等，其中TGF-β1是MF的重要刺激因子，TGF-β1能夠刺激CTGF 表達上調，同時 CTGF 與 TGF-β1 結合后，能刺激samd 磷酸化，啟動MF 過程，因此二者相互促進，共同參與促纖維化效應，CTGF 與TGF-β1 一同作用導致哺乳動物多數臟器如腎、肺、心臟等發生纖維化［17］。JNK 是 TGF-β1-samd/TAK1 通路下游信號因子，當JNK 被激活后，磷酸化Samd 2/3 信號轉導至細胞核內，形成Samd 2/3、Samd 4、CBP、TF 復合物，介導Ⅰ型和Ⅲ膠原蛋白表達。同時，JNK 還可通過Rac1/MLK3/JNK/AP-1 通路介導Ⅰ型膠原蛋白表達。在AMI 體外模型中，加入JNK 抑制劑可顯著減少心肌細胞的凋亡［18］。研究［19］表明，JNK 被激活可引起小鼠炎癥因子增加、心肌細胞肥大、基質增生、心肌細胞死亡。CTGF 和JNK 間存在復雜的通路聯系，UTSUGI 等［20］在肺纖維化病理機制研究中發現，TGF-β1-samd/TAK1 信號通路在激活 CTGF 時，JNK在介導CTGF 表達升高起到重要作用。P38-MAPK作為samd 下游的信號分子，是MAPK 信號通路的主要成員，參與了心肌組織纖維化的發生發展，在誘發纖維化過程發展中起著至關重要的作用。有研究表明，在TGF-β1 的信號傳遞過程中，對P38 基因的表達干預將會下調TGF-β1的活性，對組織纖維化的過程起到延緩作用。以上研究表明，抑制TGF-β1-samd/TAK1及下游信號因子通路可能成為降低AMI后大鼠MF 的新靶點。本研究結果顯示，TGF-β1 組CTGF、JNK 及P38 mRNA 表達顯著增加，經 GBE 治療后三者均降低，且高劑量組減低明顯，認為可能與GBE 的劑量有關，提示GBE 可能通過抑制TGF-β1-samd/TAK1下游信號通路活化，進而抑制CFb增殖，達到延緩心肌纖維化的作用。

綜上所述，對于 TGF-β1 誘導增殖的 CFb，GBE對其增殖具有明顯的生長抑制作用，且可能的機制是通過下調TGF-β1-samd/TAK1 信號通路中CTGF、JNK、P38 基因的表達。因此，提示GBE 對心肌纖維化的發展起到延緩作用。