胰腺癌患者血清外泌體酪氨酸蛋白激酶受體EphA2蛋白表達(dá)變化及其意義

魏倩，李澤，馮紅蕾

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/天津市腫瘤防治重點實驗室/天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060

胰腺癌是一類惡性程度很高的消化道腫瘤，全球的五年生存率僅為4%，是世界癌癥相關(guān)死亡的第四大主要原因［1］。由于其早期的隱匿性和高侵襲性，大部分患者在發(fā)現(xiàn)的時候已經(jīng)處于晚期，失去了手術(shù)及治療的機會［2］。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，治療手段在不斷的提高，但對化療藥物的耐藥性使得大部分胰腺癌患者預(yù)后依然較差［3］。因此，加強相關(guān)研究并尋找新型標(biāo)志物和藥物載體對胰腺癌的早期診斷和臨床療效至關(guān)重要。外泌體是一類由細(xì)胞分泌的40～150 nm 的微小囊泡，可以攜帶大量的功能性物質(zhì)如核酸、miRNA 和蛋白，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程和各種生理信息傳遞［4］。已經(jīng)有大量的文獻［5］報道血液中的外泌體在臨床診斷和治療上的重要意義。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，外泌體攜帶的酪氨酸蛋白激酶受體EphA2 蛋白可以提高胰腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力及耐藥能力［6-7］，但是在血液中的功能作用及相關(guān)性研究較少。本研究觀察了胰腺癌患者血清外泌體EphA2 蛋白表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院2016年10 月—2017 年10 月收治并診斷為胰腺癌的患者105 例，記為胰腺癌組。胰腺癌組患者中，105 例男60 例、女 45 例，年齡（52.5 ± 10.4）歲，腫瘤 TNM 分期Ⅰ期+Ⅱ期35 例、Ⅲ期+Ⅳ期70 例，有酗酒史者21例，有長期吸煙史者45 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者76 例。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為胰腺癌；②均為首次診斷，未進行過放療或化療；③患者不存在胰腺癌以外的其他原發(fā)惡性腫瘤；④患者臨床病理資料完整并接受隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他原發(fā)的消化系統(tǒng)腫瘤；②患者臨床資料不全。另選取同期體檢健康者70例，記為健康組，其中男37例、女33 例，年齡（46.4 ± 7.8）歲。兩組基本資料具有可比性。本研究通過天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 兩組血清外泌體EphA2 蛋白檢測及分析 采用酶聯(lián)免疫法。收集胰腺癌患者術(shù)前和健康者的新鮮血清，在?80 ℃冰箱中保存，禁止反復(fù)凍融。取 250 μL 血清，3 000 g 離心 5 min，去掉沉淀，然后加入63 μL 外泌體試劑純化液，混勻后4 ℃靜置30～60 min，4 ℃條件下1 500 g 離心30 min，棄掉上清，將沉淀物用100 μL PBS溶解。在96孔板中加入100 μL 的抗 EphA2 血清抗體，過夜孵育，清洗之后封閉1 h，隨后加入待檢血清標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)液和陰性對照，在室溫下孵育2.5 h 后清洗液清洗三次，然后加入檢測抗體，室溫孵育2 h，之后加入鏈霉親和素溶液并孵育45 min，沖洗三次后加入顯色劑顯色30 min，終止液終止，使用680 型酶標(biāo)儀在450 nm 處測定吸光度值，以吸光度值表示血清外泌體EphA2蛋白的表達(dá)水平。以胰腺癌患者血清外泌體EphA2蛋白表達(dá)水平中位數(shù)為臨界值，將105 例胰腺癌患者分為EphA2蛋白高表達(dá)者、EphA2蛋白低表達(dá)者，分析血清外泌體EphA2 蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.3 胰腺癌患者隨訪及預(yù)后分析 自患者出院起，每1～3個月隨訪一次，隨訪時間3～36個月，隨訪至終止時間或患者死亡，隨訪時間截至2020 年10 月。以胰腺癌患者血清外泌體EphA2 蛋白表達(dá)水平中位數(shù)為臨界值，將隨訪資料完整的胰腺癌患者分為EphA2 蛋白高表達(dá)組、EphA2 蛋白低表達(dá)組，采用Kaplan-Meier 生存分析法分析血清外泌體EphA2 蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 和GraphPad Prism Software 5.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清外泌體EphA2 蛋白表達(dá)水平比較胰腺癌組、健康組血清外泌體EphA2 蛋白表達(dá)水平分別為（1 956 ± 216）ng/L、（474 ± 51）ng/L，兩組相比，P＜0.05。

2.2 血清外泌體EphA2 蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 血清外泌體EphA2蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系見表1。由表1可知，血清外泌體EphA2蛋白表達(dá)水平與胰腺癌TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），與患者的性別、年齡、吸煙史、酗酒史無關(guān)（P均＞0.05）。

2.3 血清外泌體EphA2 蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 105例患者中100例隨訪成功，隨訪3 年內(nèi)共有73 例患者死亡，3 年總生存率為27.0%。其中，EphA2 蛋白高表達(dá)組 47 例、EphA2 蛋白低表達(dá)組53 例。EphA2 蛋白高表達(dá)組、EphA2 蛋白低表達(dá)組胰腺癌患者的生存曲線見圖1。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，EphA2 蛋白高表達(dá)組3 年生存率為 14.9%（7/47），EphA2 蛋白低表達(dá)組 3 年生存率為37.7%（20/53），兩組患者3 年生存率相比，P＜0.05。

3 討論

胰腺癌是一種病死率相對較高的癌癥，治療內(nèi)容主要包括手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)手段［8-9］。由于其早期癥狀不明顯及高侵襲轉(zhuǎn)移性，使得疾病的進展迅速，大部分胰腺癌患者在診斷時已經(jīng)轉(zhuǎn)移進入晚期［10］。近年來，在臨床診斷上糖類抗原19-9 成為胰腺癌最常見的血清生物標(biāo)志物，但其敏感性和特異性相對較差［11-12］。而由于胰腺癌患者對放化療的高耐藥性，使得患者的預(yù)后效果也差強人意［13］。因此，為了加強胰腺癌的診斷水平和預(yù)后評估，我們試圖尋找和評估新的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物。

表1 血清外泌體EphA2蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系（例）

圖1 EphA2蛋白高表達(dá)組、EphA2蛋白低表達(dá)組胰腺癌患者的生存曲線

近年來，越來越多的研究證實外泌體在細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮了十分重要的作用。這種分子囊泡的雙層結(jié)構(gòu)和高濃度的脂質(zhì)成分，決定了其在細(xì)胞外環(huán)境中的穩(wěn)定性，并構(gòu)成了外泌體轉(zhuǎn)運的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［14］。外泌體作為載體攜帶大量功能性物質(zhì)（如核酸、miR?NA 和蛋白）參與了機體的各項生理和病理過程，包括新血管生成、細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答和腫瘤侵襲等等［15-16］。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及診療過程中，外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間信息通訊并影響細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境間的關(guān)系。目前，外泌體在腫瘤治療中的臨床應(yīng)用主要包括早期檢測、預(yù)后評估、免疫系統(tǒng)刺激劑以及靶向藥物的載體運輸［17-18］。隨著對液體活檢的可測性了解的增加，新型腫瘤標(biāo)志物診斷和預(yù)后的開發(fā)已經(jīng)成為腫瘤治療一個廣泛的研究領(lǐng)域。外泌體所含有的原始細(xì)胞的特定分子和其穩(wěn)定性及豐富性，使得其作為其新的標(biāo)志物在聯(lián)合檢測和預(yù)后監(jiān)測中發(fā)揮出巨大的優(yōu)勢。例如，最近研究表明glypican-1蛋白是一種新的有潛力用于胰腺癌診斷的生物標(biāo)志物，它通常在癌細(xì)胞中富集。同樣，在胰腺癌患者的血清中檢測到了外泌體蛋白glypican-1，具有極高的特異性和敏感性，可以用來區(qū)分健康人、良性疾病患者和早晚期胰腺癌患者［19］。除此之外，研究報道細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白4（CKAP4）與分泌性蛋白DKK1 在胰腺導(dǎo)管腺癌中的同時表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)，提示其可能成為胰腺癌治療的生物標(biāo)志物和分子靶標(biāo)［20］。

EphA2 蛋白已經(jīng)證實在乳腺癌、卵巢癌及肺癌等多種癌癥中都高表達(dá)，發(fā)揮癌基因的功能［21-23］。它通過促進細(xì)胞增殖和侵襲，在癌癥的進展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。同樣，分子研究證實EphA2 的過度表達(dá)會增加體外胰腺癌細(xì)胞系的遷移侵襲力和對吉西他濱的耐藥性，而誘導(dǎo)EphA2 基因的敲除則有相反的效果。EphA2 siRNA 還能夠減少胰腺癌小鼠腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，以及增加腫瘤相關(guān)的細(xì)胞凋亡［6-7］。血清外泌體EphA2 蛋白是否在液體活檢中發(fā)揮同樣的功能，作為胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物還未可知。

本研究中證實血清中外泌體EphA2 蛋白在胰腺癌患者體內(nèi)高表達(dá)，并與患者的腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。同時研究發(fā)現(xiàn)，血清中外泌體EphA2蛋白表達(dá)陽性的患者3 年生存率低于陰性組，原因可能是外泌體EphA2 蛋白的高表達(dá)加強改變了患者本身對化療藥物的耐藥性［7］。說明外泌體EphA2蛋白的高表達(dá)很可能與胰腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)，并有可能成為胰腺癌預(yù)后不良的腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述，胰腺癌患者血清外泌體EphA2 蛋白表達(dá)水平升高，與胰腺癌TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；血清外泌體EphA2 蛋白高表達(dá)的胰腺癌患者3年生存率低。胰腺癌患者血清外泌體EphA2 蛋白可以作為胰腺癌潛在預(yù)后評估標(biāo)志物。