腦癱差異表達(dá)基因生物信息學(xué)分析及腦癱核心驅(qū)動(dòng)基因篩選

曾杰，徐林，趙亞林，鄧博文，于睿欽，趙毅，穆曉紅

北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700

腦性癱瘓（簡稱腦癱）是最常見的兒童致殘性疾病，是發(fā)育中的大腦中出現(xiàn)非進(jìn)行性損傷引發(fā)永久性的運(yùn)動(dòng)和姿勢(shì)發(fā)育障礙，進(jìn)而導(dǎo)致患者活動(dòng)受限，其中運(yùn)動(dòng)功能障礙是腦癱的核心癥狀。歐洲部分國家數(shù)據(jù)顯示，腦癱總體患病率為2.08‰，其中極低出生體質(zhì)量兒的患病率為42.4‰［1］，加拿大兒童腦癱患病為2.2‰，受到人口預(yù)期壽命延長的影響，腦癱患病率仍在緩慢增加［2］。我國部分地區(qū)隨機(jī)抽樣調(diào)查顯示，0～6 歲兒童腦癱的患病率為 2.37‰［3］。腦癱給醫(yī)療保障系統(tǒng)和家庭造成巨大壓力，同時(shí)腦癱患者自身生活質(zhì)量也受到極其嚴(yán)重的影響。目前尚無能夠治愈腦癱的治療方法，對(duì)腦癱做到早期診斷和干預(yù)，探索腦癱相關(guān)的差異表達(dá)基因和治療靶點(diǎn)，對(duì)于降低腦癱發(fā)病率、改善患者預(yù)后和降低殘障率具有重要的意義。近年來，隨著基因芯片和高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，研究者能夠快速實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組和基因組的全貌細(xì)致分析，有力推動(dòng)了生命科學(xué)的發(fā)展進(jìn)步。隨著針對(duì)腦癱基因表達(dá)譜等相關(guān)研究的逐年增加和各類公共數(shù)據(jù)庫的建立，可通過生物信息學(xué)方法對(duì)腦癱進(jìn)行更深層次的研究，進(jìn)而拓展對(duì)腦癱病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本研究通過檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，獲取腦癱的差異表達(dá)基因，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并篩選出腦癱核心驅(qū)動(dòng)基因，為下一步研究提供方向。

1 資料與方法

1.1 腦癱差異表達(dá)基因的獲取 通過檢索Pubmed（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed/）數(shù)據(jù)庫，檢索與腦癱差異表達(dá)基因相關(guān)的文獻(xiàn)，檢索式為：（cerebral palsy ［MeSH］） and （polymorphism［MeSH］or genotype［MeSH］or alleles［MeSH］）not（neoplasms［MeSH］），截至2020 年10 月5 日共檢索到英文文獻(xiàn)120 篇，通過閱讀文獻(xiàn)摘要，收集與人類相關(guān)的遺傳關(guān)聯(lián)研究，其后審閱選定文獻(xiàn)的全文，確保其內(nèi)容支持結(jié)論，最后納入英文文獻(xiàn)44 篇。同時(shí)，在中國知網(wǎng)檢索獲取腦癱差異表達(dá)基因相關(guān)文獻(xiàn)，檢索主題詞為“腦性癱瘓”“基因”“易感性”“多態(tài)性”，進(jìn)行模糊匹配，排除綜述、動(dòng)物研究以及與腦癱無關(guān)的研究后，最終得到有效中文文獻(xiàn)12篇，閱讀全文并獲取文章中的腦癱差異表達(dá)基因。

1.2 腦癱差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

1.2.1 腦癱差異表達(dá)基因的GO 功能富集分析利用 WebGestalt（http：//www. webgestalt. org/）對(duì)腦癱差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，以此探索參與腦癱的主要生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05的條目為顯著富集標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 腦癱差異表達(dá)基因的KEGG 信號(hào)通路分析 將腦癱差異表達(dá)基因上傳至ToppGene（https：//toppgene. cchmc. org/）進(jìn)行 KEGG 信號(hào)通路分析，采用benjamini-hockberg 算法對(duì)顯著性結(jié)果進(jìn)行多重檢驗(yàn)的校正，選擇KEGG 數(shù)據(jù)庫對(duì)腦癱差異表達(dá)基因參與的信號(hào)通路進(jìn)行注釋，以FDR＜0.01作為顯著富集的通路。

1.2.3 腦癱差異表達(dá)基因的通路串話分析 通路串話分析基于以下假設(shè)：如果兩條信號(hào)通路之間共享2 個(gè)及以上腦癱差異基因，那么這兩條信號(hào)通路即具有通路串話關(guān)系。為準(zhǔn)確描述每兩條任意信號(hào)通路對(duì)之間的基因重合關(guān)系，本研究利用杰卡德相似系數(shù)（JC）和重疊系數(shù)（OC），將JC 和OC 的平均值作為衡量兩條通路間基因重復(fù)關(guān)系的指標(biāo)，然后利用Cytoscape 軟件將具有串話關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入并進(jìn)行可視化。以節(jié)點(diǎn)代表信號(hào)通路，網(wǎng)絡(luò)中與某個(gè)信號(hào)通路具有串話關(guān)系的通路越多，則該信號(hào)通路的節(jié)點(diǎn)越大；以邊代表通路對(duì)之間的串話關(guān)系，通路對(duì)之間重合基因越多，則連接兩條通路的邊越粗。

1.3 腦癱核心驅(qū)動(dòng)基因的篩選 將腦癱差異表達(dá)基因上傳至 STRING 11.0 軟件（https：//string-db.org/），構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），隨后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，利用該軟件中的cytoHubba 插件并使用最大團(tuán)中心性（MCC）方法，篩選出蛋白間相互作用對(duì)數(shù)排名前10的差異表達(dá)基因，即為腦癱核心驅(qū)動(dòng)基因。

2 結(jié)果

2.1 腦癱差異表達(dá)基因的獲取結(jié)果 通過Pubmed和中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫檢索得到298 個(gè)腦癱差異表達(dá)基因 ，包 括 NOS2、IL1B、APOE、TUBA1A、SCN8A、KDM5C、AGAP1、KDM7A、MAST1、NAA35、IL6、SLC1A2、F5、TLR4、COL4A1、PRKG2等基因。

2.2 腦癱差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 腦癱差異表達(dá)基因的GO 功能富集分析結(jié)果 GO功能富集分析結(jié)果顯示，腦癱差異表達(dá)基因在生物學(xué)過程方面主要與免疫應(yīng)答、防御反應(yīng)、對(duì)含氧化合物的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、對(duì)生物刺激的反應(yīng)、對(duì)其他生物體的反應(yīng)、細(xì)胞活化、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)進(jìn)程調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子刺激的反應(yīng)、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元的產(chǎn)生等有關(guān)，在細(xì)胞組分方面主要與軸突、突觸后膜、突觸、細(xì)胞膜的固有成分、細(xì)胞連接等有關(guān)，在分子功能方面主要與蛋白聚糖結(jié)合、膠原結(jié)合、抗原結(jié)合、抗氧化活性、細(xì)胞骨架的成分、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體-配體活性等有關(guān)。

2.2.2 腦癱差異表達(dá)基因的KEGG 信號(hào)通路分析結(jié)果 最終獲得42 條顯著富集的通路，涉及免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路有Th17 細(xì)胞分化、Toll 樣受體信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、趨化因子信號(hào)通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路、抗原處理和呈遞等，涉及神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)通路有軸突導(dǎo)向、PI3K-Akt 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、縫隙連接等。此外，還富集得到一些感染性疾病如百日咳、丙肝、麻疹、美洲錐蟲病等和炎癥性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、癌癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥等疾病的信號(hào)通路。KEGG 信號(hào)通路分析結(jié)果也表明，腦癱的病理機(jī)制涉及到免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)和多途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

2.2.3 腦癱差異表達(dá)基因的通路串話分析結(jié)果 42條信號(hào)通路中經(jīng)串話分析最終保留41條通路，即41 條信號(hào)通路中任意一條都與其他若干條信號(hào)通路共享2個(gè)及以上的基因。腦癱差異表達(dá)基因的通路串話關(guān)系網(wǎng)絡(luò)見圖1。由圖1可見，該網(wǎng)絡(luò)包括41 個(gè)節(jié)點(diǎn)、477 條邊，其中T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白多糖、Th17細(xì)胞分化、NOD 樣受體信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路與其他的通路之間存在較多的串話關(guān)系，可能在腦癱的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

圖1 腦癱差異表達(dá)基因的通路串話關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

2.3 腦癱核心驅(qū)動(dòng)基因的篩選結(jié)果 獲得一個(gè)包含263 個(gè)節(jié)點(diǎn)、1585 條邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)，其中蛋白間相互作用對(duì)數(shù)排名前10 的基因是IL-6、TNF、IFNG、CXCL8、TLR4、ICAM1、IL-4、IL-1β、CCL5、PTGS2，腦癱差異表達(dá)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖2。

圖2 腦癱差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

目前尚不完全清楚腦癱發(fā)病的具體病理機(jī)制，一般認(rèn)為腦癱的病因涉及產(chǎn)前、產(chǎn)中和產(chǎn)后的多個(gè)關(guān)節(jié)，與缺氧、早產(chǎn)、感染、黃疸、低出生體質(zhì)量、新生兒腦病及遺傳因素等有關(guān)［4］，缺氧是腦癱的主要病因［5］。借助基因組學(xué)、分子遺傳學(xué)、蛋白組學(xué)等技術(shù)手段，人們對(duì)腦癱的認(rèn)識(shí)和研究不斷推向深入，遺傳因素和易感基因也走進(jìn)了研究者的視野，成為腦癱研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。遺傳因素可能會(huì)改變圍產(chǎn)期炎癥和神經(jīng)發(fā)育障礙的易感性，誘導(dǎo)腦癱等神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病的發(fā)生。此外，出生前后的環(huán)境暴露可影響嬰兒的表觀遺傳標(biāo)記物，生命早期的表觀遺傳標(biāo)記物能夠預(yù)測數(shù)年后的神經(jīng)發(fā)育結(jié)果。基因靶向精準(zhǔn)治療已成為多種惡性腫瘤治療的重要手段，基于表觀遺傳途徑實(shí)現(xiàn)基因?qū)用娴恼{(diào)節(jié)也可能為腦癱等疾病的新治療策略提供有希望的方向［6-7］。

在本研究中，通過分析中英文相關(guān)文獻(xiàn)，提取腦癱差異表達(dá)基因298 個(gè)，并對(duì)該基因集進(jìn)行富集分析和PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。GO 功能富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要匯集于免疫應(yīng)答和神經(jīng)發(fā)生等生物學(xué)過程，涉及到的細(xì)胞組分主要有軸突、突觸后膜等，分子功能主要涉及蛋白聚糖結(jié)合、膠原結(jié)合等；KEGG 信號(hào)通路分析表明，差異表達(dá)基因富集于與免疫系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的信號(hào)通路，如Th17細(xì)胞分化、Toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、軸突導(dǎo)向、PI3K-Akt 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、縫隙連接等。對(duì)富集到的信號(hào)通路進(jìn)行串話分析證實(shí)，T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等與其他信號(hào)通路具有較明顯的串話關(guān)系。

本研究還通過構(gòu)建差異表達(dá)基因PPI 網(wǎng)絡(luò)，獲得10 個(gè)核心驅(qū)動(dòng)基因，分別是IL-6、TNF、IFNG、CX?CL8、TLR4、ICAM1、IL4、IL-1β、CCL5、PTGS2 等，說明上述基因可能在腦癱發(fā)病的蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制中扮演了重要角色。研究［8］發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α是最能預(yù)測神經(jīng)發(fā)育損傷的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物。IL-6 是腦室周圍白質(zhì)軟化癥（PVL）相關(guān)病變的獨(dú)立預(yù)測因子，可增加早產(chǎn)兒對(duì)不良神經(jīng)發(fā)育結(jié)局的易感性［9-10］，IL-6 和 IL-8 均可明顯增加腦癱的患病風(fēng)險(xiǎn)［11］。此外，腦癱患者血漿TNF-α 水平明顯高于正常對(duì)照組，且TNF-α 水平與疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)［12］。IL-1β 在缺血缺氧性腦病的神經(jīng)炎癥機(jī)制中起關(guān)鍵作用。有研究［13］證實(shí)，在 IL-1β 基因啟動(dòng)子的511 位點(diǎn)攜帶單核苷酸多態(tài)性（SNIP），以及在NOS2A 啟動(dòng)子中CCTTT 微衛(wèi)星的擴(kuò)增，可能使患兒在缺血缺氧性腦病后更容易發(fā)生腦癱。TLR4屬I型跨膜蛋白，通過MyD88 依賴和非MyD88 依賴性途徑被活化，其后激活巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)炎癥和免疫調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)。有臨床研究［14］顯示，TLR-4多態(tài)性有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用，可能與腦癱風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)。IFNG 具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，表現(xiàn)為當(dāng)病原體入侵宿主時(shí)，IFNG 激活巨噬細(xì)胞使之殺滅病原體，形成免疫應(yīng)答的第一道防線［15］。CCL5屬于C-C趨化因子家族，可將白細(xì)胞募集到炎癥部位中起抗炎作用。在大腦中，CCL5能夠誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞系oli-neu細(xì)胞增殖，促進(jìn)髓鞘形成，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，抵抗神經(jīng)毒素發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［16］。ICAM1能夠促進(jìn)白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移到炎癥部位，破壞血腦屏障，CAM1 的上調(diào)發(fā)生在多種疾病中，包括自身免疫性疾病、癌癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和炎性疾病等。在炎癥條件下，ICAM1 升高會(huì)增加患兒腦白質(zhì)受損和罹患腦癱的風(fēng)險(xiǎn)［11］。PTGS2被認(rèn)為是緩解疼痛和治療炎癥的靶標(biāo)［17］，在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中PTGS2 的表達(dá)顯著增加，PTGS2 作為神經(jīng)毒性介質(zhì)，可能是導(dǎo)致神經(jīng)變性、精神疾病和癲癇的病理因素［18］。

綜上，本研究通過檢索文獻(xiàn)收集腦癱差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法，對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程和Th17細(xì)胞分化等信號(hào)通路可能參與了腦癱的發(fā)病機(jī)制；通過構(gòu)建差異表達(dá)基因PPI 網(wǎng)絡(luò)，獲取可能參與腦癱發(fā)病的核心驅(qū)動(dòng)基因。上述靶點(diǎn)和信號(hào)通路可能在腦癱的發(fā)生發(fā)展過程中有重要的影響和作用，值得在下一步的研究中進(jìn)行深入探討。