POCD 小鼠海馬組織中差異表達miRNA 的篩選、靶基因預測和生物信息學分析及其調控機制探討

張英立，劉乘麟，于明懂，王瑩，胡南，盧悅淳，呂國義

1 天津醫科大學第二醫院，天津300211；2 天津市天津醫院；3 天津醫科大學腫瘤醫院

圍手術期神經認知障礙（PND）是由麻醉學、神經病學、老年病學、精神病學、神經心理學、外科學以及心理學等多個學科專家共同命名的，通常指術前和術后12 個月之內發生的，包含術后譫妄（POD）以及術后認知功能障礙（POCD）在內的所有圍手術期認知功能改變［1-2］。POCD 是老年患者術后常見的并發癥，表現為記憶力、注意力以及判斷力的下降，目前臨床上缺乏有效的防治措施。盡管目前對于POCD 的研究層出不窮，研究者提出各種假說試圖揭示POCD 的發病機制，如神經系統炎癥、氧化應激、自噬障礙、突觸功能受損等［4］，其潛在的發病機制仍無定論。miRNA 是一類能夠調節基因表達的短單鏈內源性非編碼RNA，長度約為22 nt，通過與互補的mRNA 選擇性的結合，可抑制相關蛋白的產生。大腦中含有豐富的miRNA，可特異性表達于特定的細胞、組織甚至發育的不同階段［5］。目前研究表明，miRNA 在與神經系統相關的發育、學習、記憶中起著重要的作用，其異常表達可以導致許多神經系統的疾病［6-7］。本研究基于基因公共表達數據庫（GEO 數據庫），通過分析GEO 數據庫中miRNA 表達譜數據，利用生物信息學方法，比較POCD 和正常小鼠海馬組織中miRNA 的差異性表達，預測其靶基因，以期構建POCD 小鼠海馬組織中差異表達的miRNA-mRNA 調控網絡，為POCD 分子機制的進一步研究提供基礎。

1 資料與方法

1.1 POCD 小鼠海馬組織與正常小鼠海馬組織基因表達譜數據的獲取 以“POCD”、“Mus muscu?lus”、“miRNA”為關鍵字，在GEO 數據庫中搜索下載符合條件的芯片數據GSE95070，包括5 個POCD 小鼠海馬組織樣本和5個正常小鼠海馬組織樣本，檢測平臺為 GPL19117（Affymatrix Multispecies miRNA-4 Array）。

1.2 POCD 小鼠海馬組織與正常小鼠海馬組織中差異表達miRNA（DEMs）的篩選 將芯片數據進行處理和矯正后，基于R 軟件（版本3.6.2）的limma 函數包篩選出差異表達的miRNA，即DEMs。DEMs 的篩選閾值為P＜0.05和|log2FC|≥2。

1.3 DEMs 靶基因（DEGs）的預測 將DEMs 分別輸 入 到 miRTarBase（http：//mirtarbase. mbc. nctu.edu. tw/php/index. php）、TargetScan（http：//www.targetscan. org/）、miRDB（http：//www. mirdb. org/）數據庫中，預測其靶基因，選擇三個數據庫中皆存在的靶基因，認定為差異表達的DEMs 靶基因，即DEGs。

1.4 DEGs 的基因本體（GO）功能富集分析和KEGG 信號通路分析 GO 功能富集分析是一個描述基因功能的生物學模型框架，它從分子功能、細胞組分和生物學過程三個方面對基因功能進行描述和分類［8］。KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）是一個數據庫的集合，收集了大量基因組數據、信號通路、藥物、疾病的相關信息［9］。使用 R 軟件中的 gg?plot2、enrichplot 函數包對 DEGs 進行了 GO 功能富集分析和KEGG 信號通路分析，認定P＜0.05 為差異具有統計學意義，達到顯著富集。

1.5 DEGs 蛋白互作網絡（PPI）的構建及小鼠POCD 發生發展樞紐基因的篩選 STRING（http：//string-db.org/）是用于評估蛋白質-蛋白質之間相互作用的在線數據庫。為了明確DEGs 之間的相互作用關系，我們將DEGs 輸入到STRING 數據庫，構建PPI 網絡。將蛋白間相互作用得分＞0.4 的節點輸入到可視化工具Cytoscape 軟件中，利用cytoHubba 插件，根據Degree 算法計算基因的節點度，篩選出節點度值排名前10 的節點，即為可能參與小鼠POCD發生發展的樞紐基因。

1.6 POCD 小鼠海馬組織中差異表達miRNA-mRNA 調控網絡圖的構建 選取10個小鼠POCD 發生發展的樞紐基因，并找出其相應的DEMs，利用Cytoscape 軟件構建POCD 小鼠海馬組織中差異表達miRNA-mRNA調控網絡圖。

2 結果

2.1 POCD 小鼠海馬組織與正常小鼠海馬組織中DEMs 的篩選結果 GSE95070 中有 2 821 個 miR?NA，共篩選出19 個顯著差異表達的DEMs，其中11個miRNA 表達上調，8 個miRNA 表達下調。表達上調的 miRNA 為 mmu-miR-28a-3p、mmu-miR-674-3p、mmu-miR-344d-3p、 mmu-miR-1839-3p、 mmu-miR-1983、mmu-miR-299b-5p、mmu-miR-125b-1、mmumiR-1934-3p、mmu-miR-3065-5p、mmu-miR-411-3p、mmu-miR-384-5p，表達下調的 miRNA 為 mmu-miR-592-3p、mmu-miR-362-3p、mmu-miR-455-3p、mmumiR-490-5p、mmu-miR-7072-5p、mmu-miR-181c-5p、mmu-miR-6981-5p、mmu-miR-107-3p。

2.2 DEGs 的預測結果 最終得到448 個DEGs，其中表達上調的DEGs包括Gsk3β、Cd34、Smad2、Smar?ca4、Grb2、Sin3a、Fam160b2、Trim2、Stk32a、Ap1g1、Gpd1l、Fam122b、Stat1、E2f3、Antxr2 等基因，表達下調 的 DEGs 包 括 Igf1、Ubxn7、Ncam1、Arf6、Celf2、Nr3c2、Tcerg1、Srsf1、Sytl4、Ywhah等基因。

2.3 DEGs 的GO 功能富集分析和KEGG 信號通路分析結果 GO 功能富集分析結果顯示，DEGs 主要與分子功能密切相關，在DNA 結合的轉錄因子激活活性、特異性RNA 聚合酶Ⅱ、微小GTP 酶結合等分子功能中顯著富集；生物學過程分析結果顯示，DEGs主要在樹突的形成以及調節、促進神經膠質細胞的增殖等生物學過程中顯著富集；細胞組分分析結果顯示，DEGs 主要富集于突觸膜的有機組成成分、細胞邊緣以及囊泡運輸等細胞組分中。KEGG信號通路分析結果顯示，DEGs 在Cushing 綜合征相關通路、cGMP-PKG 信號通路、Hepatitis C 信號通路、Apelin信號通路等通路中顯著富集。

2.4 小鼠POCD 發生發展樞紐基因的篩選結果小鼠POCD 發生發展的10 個樞紐基因分別為Gsk3β、Igf1、Cd34、Ubxn7、Smad2、Smarca4、Stat1、Grb2、Sin3a、Ncam1，其相互作用關系見圖1。

圖1 小鼠POCD發生發展樞紐基因的相互作用關系圖

2.5 POCD 小鼠海馬組織中差異表達miRNA-mRNA 調控網絡圖的構建結果 10 個小鼠POCD 發生發展樞紐基因相應的DEMs 共有6 個，分別為mmu-miR-362-3p、mmu-miR-3065-5p、mmu-miR-592-3p、mmu-miR-28a-3p、mmu-miR-181c-5p 以及 mmumiR-351-5p。利用Cytoscape 構建二者間的調控網絡圖，得到 10 個 miRNA-mRNA 關系對，見表 1。由表1 可知，mmu-miR-362-3p 節點度最高，可以調控Gsk3β、Smad2、Grb2、Sin3a 四個 mRNA，mmu-miR-3065-5p 可以調控 Igf1、Ncam1 兩個 mRNA。構建的POCD小鼠海馬組織中差異表達miRNA-mRNA調控網絡見圖 2，其中 mmu-miR-362-3p 調控 Gsk3β 的關系對、mmu-miR-3065-5p 調控Igf1 的關系對在調控網絡中節點度最高。

3 討論

本研究運用生物信息學方法，鑒定出POCD 小鼠海馬組織與正常小鼠海馬組織中11個上調和8個下調的差異表達的miRNA，即DEMs。miRNA 與靶基因之間存在負相關關系，其可以通過抑制后者轉錄或翻譯下調靶基因的表達。研究［10］表明，miRNA-mRNA 調控網絡與中樞神經系統密切相關。大腦中miRNA-mRNA 調控網絡失調可以導致多種人類疾病，如阿爾茨海默病（AD）［11］、帕金森?。≒D）［12］、腦梗死［13］以及缺血性腦血管疾?。?4］等。本研究發現，在所有的DEMs中，mmu-miR-362-3p節點度最高，可以調控Gsk3β、Smad2、Grb2、Sin3a四個mRNA，mmumiR-3065-5p 可以調控 Igf1、Ncam1 兩個 mRNA，其中，mmu-miR-362-3p 調控 Gsk3β 的關系對、mmumiR-3065-5p 調控Igf1 的關系對在調控網絡中節點度最高，推測Gsk3β和Igf1可能是影響POCD發展進程以及預后的關鍵基因。

表1 小鼠POCD發生發展樞紐基因及其對應的DEMs

圖2 POCD小鼠海馬組織中差異表達miRNA-mRNA調控網絡圖

POCD 在分子機制上與老年癡呆、抑郁癥、AD、PD 等神經精神疾病密切相關。研究［15］表明，患有AD 的老年人POCD 的風險增加，并且與AD 發病相關的神經信號通路參與了POCD 的病因［16］，老年人術前抑郁可增加POCD 的風險［17］。在構建的miR?NA-mRNA 調控網絡圖中，Gsk3β 和 Igf1 是節點度最高的兩個基因。Gsk3β 作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞凋亡、細胞增殖、糖原代謝等生物學進程。研究［18］表明，Gsk3β 在小鼠海馬和皮層神經元中的過度表達能導致相應區域神經元丟失和記憶缺陷。在轉基因小鼠的AD模型中，Gsk3β抑制劑能夠延緩皮質神經元Aβ 的聚集和斑塊的沉積［19］，激活Nrf2 通路，阻止認知功能障礙的產生［20］，因此，Gsk3β 抑制劑被認為是治療AD 可能的有效藥物。Gsk3β 在 PD 小鼠中表達增加，通過間接調控 Nrf2 通路，抑制PD小鼠線粒體生物過程的激活，促進PD小鼠病程的進展［21］。Igf1 是機體中重要的穩態調節因子，參與機體的許多生理代謝過程，在生長發育、壽命長短控制和衰老進程中起到重要的作用。通過影響突觸的形態和功能、神經元的興奮性以及與NMDA 受體的相互作用，Igf1 的表達導致學習和記憶的顯著改變。研究［22］發現，人類血清Igf1 水平隨年齡增長而下降，Igf1的水平降低與認知缺陷以及中樞神經系統退行性疾病相關。Igf1 在正常腦發育中起著關鍵作用，Igf1 及其受體Igf1R 基因突變會導致小頭畸形和智力障礙［23］。MARKOWSKA等［24］研究發現，在正常老年大鼠腦室內注射Igf1可以改善大鼠認知功能的下降，表現為記憶力和物體識別能力的提高。本研究結果與上述研究結果一致，盡管Gsk3β和Igf1在神經退行性疾病中的作用已經得到證實，但是其在POCD中的潛在作用尚未研究清楚，這對于探索和研究POCD的新機制和治療靶點具有重要意義。

本研究發現，差異表達的mRNA 主要富集于與Cushing 綜合征相關的通路以及cGMP-PKG 信號通路中。Cushing 綜合征是一種以內源性皮質醇增多為特點的內分泌疾病，與長期認知功能障礙、抑郁、焦慮等癥狀相關，并且在疾病緩解后癥狀可以持續存在。研究［25］表明，糖皮質激素分布于整個大腦，其中海馬體和前額葉皮質濃度最高，而前者正是大腦認知、學習和記憶的關鍵區域。海馬對糖皮質激素的缺乏和升高都很敏感，給予外源性糖皮質激素或暴露于內源性高皮質醇會導致海馬錐體細胞形態的改變和細胞丟失，損害動物的記憶能力。Cushing綜合征患者海馬體萎縮，糾正高皮質醇后海馬體積減少可以部分逆轉，仍可存在持續的認知功能異常，最常見的受影響的認知領域包括注意力、執行能力以及長短期記憶的下降，機制可能與葡萄糖利用率降低、神經元穩態失調以及神經遞質信號傳導異常相關。目前研究表明，海馬體中cGMP 水平的增加可以改善學習和鞏固記憶，尤其是在記憶形成的早期階段。cGMP-PKG 信號通路與突觸可塑性相關，其激活可以降低與年齡相關的記憶障礙。

綜上所述，本研究通過運用一系列生物信息學方法篩選POCD 小鼠海馬組織中異常表達的miR?NA，與正常小鼠海馬組織相比，POCD小鼠海馬組織中有 19 個差異表達的 DEMs 和 448 個 DEGs；DEGs與樹突的形成以及調節等有關，參與介導Cushing綜合征相關通路、cGMP-PKG 信號通路等。mmu-miR-362-3p、mmu-miR-3065-5p 等差異表達的 miRNA 可能是通過調節Gsk3β、Igf1 等靶基因的表達，影響POCD的發生發展。