共沉淀法制備透明質酸修飾超小納米氧化鐵影響因素的研究

馬蔓蔓1,2 ， 周會鴿2 ， 陳春英2 ， 曹新鑫1

(1.河南理工大學 材料科學與工程學院 ， 河南 焦作 454000 ； 2.國家納米科學中心 ， 北京 100190)

超小超順磁氧化鐵納米顆粒由于其獨特的磁學特性，優異的生物相容性及良好的長期穩定性等優勢被廣泛應用于核磁共振成像、磁熱治療、細胞示蹤和篩選等生物醫學領域[1]。雖有許多文獻報道納米氧化鐵各種不同的制備方法，但其本身精巧的設計和復雜的制備及純化方法導致反應體系難以放大，嚴重限制了它們進一步的工業化生產及走向臨床。共沉淀法由于設備簡易、操作方便和原料廉價易得而被研究人員廣泛采納，但其所制備納米顆粒的均一性和穩定性受到了極大的挑戰[2]。

透明質酸(HA)是維持皮膚結構和功能的一種生物可降解的糖胺聚糖，安全性良好[3]。HA優異的水溶性和生物相容性使其成為改善無機納米顆粒在生理條件下穩定性的良好選擇[4]。本文選擇了HA為親水性配體和阻隔劑來調控納米氧化鐵的尺寸及穩定性，設計思路如圖1所示。通過改變HA、氨水與鐵離子的比例，反應物濃度、溫度和體積等參數，采用共沉淀法合成了Fe3O4@HA納米顆粒，并通過觀測樣品的水合粒徑，透射電鏡圖像和磁滯回線等方法，探討了反應參數對Fe3O4@HA納米顆粒的水合粒徑、形貌和飽和磁化率的影響，并探索了該反應體系是否具備放大生產的潛力。

圖1 Fe3O4@HA納米顆粒設計思路

1 實驗

1.1 實驗材料與設備

化學試劑：FeCl3· 6H2O、FeCl2· 4H2O，國藥集團化學試劑有限公司，分析純；透明質酸，HA，Mw=9 kDa，華熙生物科技股份有限公司；濃氨水，西安天茂化工有限公司，分析純。

實驗設備：透射電子顯微鏡，TEM,Tecnai G2 F20 U-TWIN，FEI Company，USA；Ultrapure Milli-Q 純水儀，UPP-11-10T；納米粒度及ζ電位分析儀，Zetasizer Nano ZS,Malvern Instruments Ltd,UK；振動樣品磁強計，Quantum Design PPMS Dyna Cool；電感耦合等離子光譜儀，ICP-OES,PE8000,perkinElmer,USA。

1.2 超小納米氧化鐵的制備

HA修飾的納米氧化鐵(Fe3O4@HA)的制備方法與文獻相似[5]。1.5 g HA溶解在50 mL去離子水中，油浴升溫至80 ℃，同時鼓入氮氣30 min以去除反應體系中的氧氣。在磁力攪拌下，將溶解在稀鹽酸(2 mL，1.0 M)中的FeCl3· 6H2O (0.145 9 g，0.54 mmol)和FeCl2· 4H2O (0.071 5 g，0.36 mmol)快速注射入熱的HA水溶液中。隨后，逐滴加入濃氨水(15 mL，28%)，調節反應液的pH值為9～10。反應液在氮氣氛圍下回流40 min，然后冷卻至室溫，將反應液轉移至截留相對分子質量20 kDa的透析袋，在去離子水中透析72 h (換水8次)，以除去沒有反應的雜質。完成透析后，將透析袋內的液體過0.22 μm的濾膜并收集在一個玻璃瓶中，存放于4 ℃冰箱中備用。其他制備方法與前述類似，但通過改變HA、氨水與鐵離子的比例，反應溫度、反應物濃度和反應體系大小等反應參數來探究Fe3O4@HA納米粒子尺寸、形貌和飽和磁化率的影響因素。

1.3 超小納米氧化鐵的表征

水合粒徑測量：將不同反應條件下制備的Fe3O4@HA膠體溶液分散到去離子水中，使樣品濃度為40 μg/mL左右，超聲后用納米粒度分析儀進行測量。重復實驗3次。

穩定性：連續兩周每天定點取樣，測水合粒徑并記錄，一年后再重復測量。

TEM表征形貌：將一定濃度的Fe3O4@HA滴加到普通碳支持膜上呈現球型水珠，5 min后吸除液體，放37 ℃恒溫箱過夜即可進行TEM表征。

磁滯回線：取一些Fe3O4@HA液體凍干并記錄質量，用振動樣品磁強計測定磁滯回線。

ICP-OES：取50 μL Fe3O4@HA液體，加入雙氧水和濃硝酸進行消解，并最終用質量分數為2%的稀硝酸定容到3 mL，測定ICP-OES。

2 結果和討論

Fe3O4@HA納米顆粒是通過Fe3+和Fe2+在濃氨水的作用下，以熱的聚合物溶液為反應介質，通過共沉淀法合成的。磁性氧化鐵的形成共分為兩個階段，成核階段和生長階段[6]。隨著納米材料尺寸的減小，會出現一些獨特的性質，例如小尺寸納米氧化鐵會出現超順磁現象，可以使磁性納米氧化鐵完全受外加磁場的調控，沒有磁滯現象[7]。此外，磁性納米顆粒的尺寸和形貌在藥物負載和運輸等方面有重要的應用意義[8]。HA的投入量、反應溫度、氨水用量、反應物濃度等反應參數分別影響著Fe3O4@HA納米顆粒的穩定性、反應進程、生長尺寸、成核速率等[1,6,9]。這些反應參數相輔相成共同影響Fe3O4@HA納米顆粒的尺寸和形貌。

2.1 調控HA的投入量

HA在反應過程中發揮了阻隔劑和穩定劑的作用，對Fe3O4@HA的粒徑及穩定性有重要影響。通過調控HA的用量，所制備Fe3O4@HA的水合粒徑及多分散指數發生明顯變化。如圖2所示，隨著HA投入量的增加，Fe3O4@HA的水合粒徑先減小后略微增加。當HA的投入量>1.5 g時，Fe3O4@HA的水合粒徑保持在50 nm以下，當投入量<1.5 g時水合粒徑卻大于50 nm。HA 用量少時，不足以削弱磁性氧化鐵納米粒子間的作用力，顆粒易聚集，導致水合粒徑增加，在透射電鏡下也呈現出團聚的現象。當HA投入量為3 g時，可從透射電鏡圖像(圖2b)中觀察到納米顆粒雖然分散性較好，但邊界模糊，這是由于納米顆粒表面包裹太多配體的緣故。同時，溶液中多余的HA會通過橋聯作用使納米顆粒發生不同程度的聚集，從而使多分散指數提高[10]。Fe3O4@HA 的飽和磁化率并未隨HA投入量的變化而發生明顯變化，穩定在55～80 emu/g；ζ電位也一直保持在-20 mV以下，保證了納米粒子的穩定性。HA投入量對產品水合粒徑的影響見表1。

表1 HA投入量對產品水合粒徑的影響

圖2 調控HA投入量對產品水合粒徑的影響

本實驗說明：HA的投入量可影響Fe3O4@HA納米粒子的分散狀態，但對飽和磁化率和ζ電位影響較小，且其它條件不變的情況下，HA的最佳投入量為1.5 g。

2.2 調控反應溫度

在幾乎所有的化學反應中，反應溫度都發揮著重要作用。同樣，對于氧化鐵納米顆粒的成核和生長，溫度也具有重要影響[11]。為探究溫度對共沉淀法制備Fe3O4@HA顆粒的影響，保持其他條件不變，增加反應體系溫度，并對所制備樣品進行表征，見表2及圖3。

由表2可知，隨著溫度從60 ℃增加到80 ℃，Fe3O4@HA的水合粒徑從86 nm減小到42 nm。這是因為隨溫度升高，HA分子及其所結合的三價鐵離子運動速率增加，加快了它們參與Fe3O4結晶的速度，阻隔了Fe3O4納米粒子的進一步生長，從而減小了顆粒尺寸。而80 ℃與102 ℃差別不大，則說明溫度對納米顆粒影響的閾值≤80 ℃。

表2 反應溫度對產品水合粒徑的影響

由圖3a可以看出，不同溫度形成的Fe3O4@HA納米粒子的磁滯回線表明，隨著反應溫度的升高合成的磁性氧化鐵納米顆粒飽和磁化率輕微下降，但仍在55～80 emu/g。考慮到溫度越高對反應設備的要求越高，本實驗所確定的最佳反應溫度是80 ℃。

圖3 調控溫度對產品水合粒徑影響表征

2.3 調控氨水用量

表3 氨水用量對產品水合粒徑的影響

由表3可知，當氨水的投入量從5 mL增加到15 mL時水合粒徑明顯減小；當再增加氨水的濃度，使氨水投入量從15 mL增加到25 mL時，Fe3O4@HA沒有持續變小。這是因為當氨水濃度低時，溶液中少量的Fe3+和Fe2+能夠和OH-結合成核，其他游離的鐵離子參與納米粒子生長的過程，從而形成較大尺寸的納米粒子；當氨水濃度增加時，溶液中的Fe3+和Fe2+能夠充分和OH-結合，形成爆發式成核，參與Fe3O4@HA晶體成長的鐵離子變少，進而形成小尺寸納米粒子；進一步增加氨水的投入量時，會使Fe3O4@HA納米粒子的水合粒徑有所增加[13]。

圖4b透射電鏡圖像進一步證明了該現象。由圖4a可知，調控氨水的加入量對飽和磁化率影響較小，且其值穩定在55～80 emu/g。本實驗最佳的氨水加入量為15 mL。

圖4 調控氨水體積對產品水合粒徑影響表征

2.4 調控反應物濃度

為了觀察能否提高納米氧化鐵的單位體積內產量，在保持其他條件不變的情況下，增加鐵離子、氨水和HA的投入量，觀察其對Fe3O4@HA粒徑的影響，結果見表4和圖5。

由表4可知，當維持反應體積50 mL不變，增加原料投入量為原來3倍時，水合粒徑大小及透射電鏡下觀察到的形貌幾乎沒有變化，Fe3O4@HA的ζ電位和磁滯回線(圖5a)也幾乎不受影響。這說明該反應體系能夠提升單位體積內的納米氧化鐵產量，具備大規模制備的潛力。

表4 反應物濃度對產品水合粒徑的影響

圖5 調控反應物濃度對粒徑影響表征

2.5 調控反應體系大小

目前，在超小納米氧化鐵的制備中，大規模生產還是一項未完成的挑戰。隨著反應體積的增加，合成磁性納米氧化鐵的尺寸可控性變差。為驗證本反應體系能否放大，在保持其他條件不變的情況下，等比例擴大反應體系，來觀察納米顆粒的尺寸，形貌和飽和磁化率。反應體積對產品水合粒徑的影響見表5和圖6。由表5及圖6可知，雖然反應體系進行一系列的放大，但Fe3O4@HA納米粒子的尺寸、磁滯回線、形貌仍可與小反應體系保持一致。由此證明該反應體系在反應溫度為80 ℃，反應物濃度比例保持不變，進行等比例放大時，也能得到實驗室級別反應所具有的超小氧化鐵的尺寸，證明該反應具備工業化的潛力。

表5 反應體積對產品水合粒徑的影響

圖6 調控反應體積對粒徑影響表征

為了進一步驗證該反應的大規模制備潛力，在反應體系體積為500 mL的基礎上將反應物的濃度增加3倍，并對所得樣品進行純化，得到2 L的Fe3O4@HA膠體溶液(圖7f)。為了證明該放大方法對Fe3O4@HA納米顆粒理化性質的影響較小，對所得到的納米顆粒進行表征，結果如圖7所示。由圖7a傅里葉紅外光譜圖可以看出，在596 cm-1處出現了Fe—O特征峰，證明氧化鐵納米顆粒的合成；且在1 033 cm-1和1 613 cm-1處又分別出現了HA上伯醇C—O的伸縮振動峰和—COO—的反對稱伸縮振動峰，證明放大反應對HA在Fe3O4納米顆粒上的包覆幾乎沒有影響。此外，所得到的Fe3O4@HA納米粒子的尺寸仍在40 nm左右(圖7b)，飽和磁化率為58.8 emu/g(圖7d)，與小反應體系所制備的Fe3O4納米顆粒保持相近的水合動力學尺寸和磁學性質。為了進一步驗證該放大方法對Fe3O4納米顆粒穩定性的影響，我們進行了為期1年的穩定性測試，結果表明，該納米顆粒的膠體溶液可穩定至少1年。

3 結論

在初始反應體積為50 mL的反應體系中控制HA用量為1.5 g，溫度80 ℃，氨水15 mL時，可制備出水合粒徑約40 nm，飽和磁化率為-60 emu/g的超小超順磁Fe3O4@HA納米顆粒。在該反應條件下，增加反應物濃度和反應體積，可成功制備出和實驗室規模下相似的Fe3O4@HA納米顆粒，證明該反應體系具備放大生產的潛力。本文能夠為使用共沉淀法制備均一、穩定的納米氧化鐵和其他無機納米顆粒及它們的大規模制備提供借鑒。

圖7 放大制備的Fe3O4@HA納米顆粒