甲哌钅翁通過(guò)調(diào)節(jié)棉花葉片水分平衡和光合性能提高苗期耐旱性的生理機(jī)制

王玉賢，董瑩瑩，李芳軍，杜明偉，田曉莉，李召虎

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 作物化控研究中心/ 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑教育部工程研究中心，北京 100193）

我國(guó)是原棉生產(chǎn)大國(guó)，棉花種植區(qū)域主要分布在干旱和半干旱地區(qū)，常受到春旱、伏旱或秋旱的威脅， 其中春旱對(duì)出苗和苗期生長(zhǎng)影響較大。 干旱脅迫下，植物會(huì)在組織和細(xì)胞水平發(fā)生多種生理生化反應(yīng)啟動(dòng)脅迫應(yīng)答，如積累脯氨酸等低分子量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)防止細(xì)胞失水[1]；積累超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶和抗壞血酸等抗氧化物質(zhì)消除過(guò)多的活性氧[2]；形成水通道蛋白、晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白（Late embryogenesis abundant，LEA）等具有保護(hù)和調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的蛋白[3]；以及加快根系生長(zhǎng)增強(qiáng)吸水能力、減少蒸騰增加保水能力[4]。此外，耐旱性強(qiáng)的物種或品種能減輕干旱對(duì)葉綠素含量和凈光合速率的負(fù)面影響，保護(hù)光合系統(tǒng)Ⅱ[5-6]。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不僅可以調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育， 也可以提高植物抵抗生物和非生物逆境的能力[7-9]。甲哌钅翁（Mepiquat chloride，DPC）是在棉花生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[10]，通過(guò)抑制赤霉素（Gibberellin，GA）關(guān)鍵合成酶柯巴基焦磷酸合酶 （Ent-copalyl diphosphate synthase，CPS）和內(nèi)根-貝殼杉烯合酶（Ent-kaurene synthase，KS）編碼基因的表達(dá)降低內(nèi)源GA 含量，從而延緩莖枝的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[11]。 此外，有研究表明DPC 浸種可增強(qiáng)作物抵御苗期干旱脅迫的能力[12-16]，但存在延遲出苗、降低出苗率的風(fēng)險(xiǎn)[17]。為明確棉花苗期葉面噴施DPC 是否也具有提高棉株抗旱能力的作用，本文從形態(tài)、光合特性、水分平衡及利用等方面進(jìn)行了探索。研究結(jié)果不僅可挖掘DPC的調(diào)控潛力，而且有助于完善其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018―2019 年在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物培養(yǎng)室進(jìn)行。 試驗(yàn)材料為陸地棉（Gossypium hirsutumL.）品種中棉所41，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所和河北省河間市國(guó)欣農(nóng)村技術(shù)服務(wù)總會(huì)提供。DPC 為98%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）可溶性粉劑，由河北國(guó)欣諾農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供。

挑選飽滿(mǎn)一致的棉花種子， 在3%過(guò)氧化氫溶液中浸泡15 min，之后用清水沖洗3～5 次、用去離子水沖洗2 次，于28 ℃下避光浸種12 h。 挑選露白一致的種子播種于裝有450 g 混土（營(yíng)養(yǎng)土和蛭石體積比為10∶1）的花盆中（直徑25 cm，高20 cm），每盆播6～8 粒種子，生長(zhǎng)至2 葉期后保留3 株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗。

培養(yǎng)室光照強(qiáng)度為（400±100）μmol·m－2·s－1，光照/黑暗時(shí)間為14h/10h，晝夜溫度為（28±2）℃/（22±2）℃，相對(duì)濕度為65%。

試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)處理：CK-Ctrl （正常供水＋噴施清水）、CK-DPC（正常供水＋噴施DPC）、DSCtrl（干旱＋噴施清水）、DS-DPC（干旱＋噴施DPC）。于2 葉期，葉面噴施濃度為30 mg·L－1的DPC，以等量清水為對(duì)照，噴至葉片完全濕潤(rùn)。 鑒于噴施DPC 后4 d 可顯著影響棉花的多項(xiàng)生理指標(biāo)[18]，因此本研究選擇DPC 處理5 d 后進(jìn)行控水干旱處理，對(duì)照組（CK-Ctrl，CK-DPC）正常供水。 正常供水處理為每2～3 d 澆1 次水，將托盤(pán)中加水直至花盆中表層土壤濕潤(rùn)后倒掉多余水分；干旱處理前澆1 次水，之后不再澆水進(jìn)行干旱處理，直至棉花幼苗出現(xiàn)干旱表型，進(jìn)行觀察和拍照記錄； 干旱處理7 d 后待棉花幼苗均呈現(xiàn)出明顯的干旱表型，拍照記錄表型，之后進(jìn)行復(fù)水，觀察植株的生長(zhǎng)恢復(fù)表型，6 h 后拍照記錄表型。各處理重復(fù)6 盆，4 個(gè)處理的植株置于同一托盤(pán)中培養(yǎng)。

1.2 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.2.1生物量。干旱處理7 d 后，取完整植株將根部沖洗干凈，用吸水紙將多余水分吸干，分離地上部和地下部， 置于105 ℃烘箱中殺青0.5 h 后將溫度調(diào)至85 ℃烘至恒重并稱(chēng)量干物質(zhì)質(zhì)量。各處理重復(fù)3 株。

1.2.2葉片相對(duì)含水量。 干旱處理5 d 后，取第2片葉稱(chēng)量鮮物質(zhì)質(zhì)量， 用去離子水浸泡至恒重，吸干表面水分后稱(chēng)量飽和鮮物質(zhì)質(zhì)量， 之后置于80 ℃烘箱中烘至恒重并稱(chēng)量干物質(zhì)質(zhì)量。 用以下公式計(jì)算葉片相對(duì)含水量（Relative water content RWC）：

相對(duì)含水量（%）＝（葉鮮物質(zhì)質(zhì)量－葉干物質(zhì)質(zhì)量）/（葉飽和鮮物質(zhì)質(zhì)量－葉干物質(zhì)質(zhì)量）×100%.

1.2.3葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量。 分別于干旱處理后0、1、2、4、6 d 取幼苗第2 片真葉， 采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定可溶性蛋白含量[19]。 參照孔祥生等[20]的方法測(cè)定游離脯氨酸含量。

1.2.4葉綠素含量。干旱處理5 d 后，使用直徑為0.6 cm 的打孔器從各處理植株的第1、2 和3 片葉取樣， 每株共取60 個(gè)葉圓片， 取樣面積為0.28 cm2。將葉圓片置入96%乙醇溶液中，避光浸提24 h 至葉片完全脫色， 使用分光光度計(jì)測(cè)定665 nm 和649 nm 處的吸光值， 按照下列公式計(jì)算葉綠素含量：

葉綠素a 濃度 （mg·L－1）＝13.95×OD665－6.88×OD649；

葉綠素b 濃度 （mg·L－1）＝24.96×OD649－7.32×OD665；

葉綠素含量（mg·cm－2）＝色素濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)/樣品面積；

總?cè)~綠素含量（mg·cm－2）＝葉綠素a 含量＋葉綠素b 含量。

1.2.5葉片光合參數(shù)。 干旱處理5 d 后，用LI-6400 便攜式光合系統(tǒng)（LI-COR，Lincoln，NE，USA）測(cè)定第2 片真葉的凈光合速率（Net photosynthetic rate，Pn）、 氣孔導(dǎo)度 （Stomatal conductance，Gs）、蒸騰速率（Transpiration rate，Tr）及胞間CO2濃度（Intercellular CO2concentration，Ci）。人工光源的光強(qiáng)為500 μmol·m－2·s－1。

1.2.6水分利用率（Water use efficiency，WUE）。WUE 按以下公式[21-22]計(jì)算：

水分利用率＝凈光合速率（Pn）/ 蒸騰速率（Tr）×1000。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、計(jì)算和作圖， 用SPSS Statistics 21 的一般線性模型（General linear model，GLM）進(jìn)行方差分析，用鄧肯多重范圍檢驗(yàn)（Duncan’s）法對(duì)各處理進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉面噴施DPC 對(duì)棉花幼苗形態(tài)和干物質(zhì)質(zhì)量的影響

就各處理棉苗生長(zhǎng)表型看（圖1A），正常供水條件下，CK-DPC 處理的棉花植株與CK-Ctrl相比葉片較小， 植株較矮。 干旱脅迫7 d 后，DS-DPC 與DS-Ctrl 處理的幼苗葉片均出現(xiàn)萎蔫，但DS-DPC 處理降低了葉片萎蔫程度。 復(fù)水6 h 后，DS-DPC 的幼苗葉片較DS-Ctrl 更快恢復(fù)平展。 根據(jù)棉苗地上部和地下部干物質(zhì)質(zhì)量變化（圖1B 和1C）， 在正常供水條件下，CK-DPC 處理抑制了植株地上部的生長(zhǎng)。 干旱脅迫7 d 后，DS-Ctrl 處理地上部干物質(zhì)質(zhì)量較CK-Ctrl 顯著下降，降幅為71.0%；而DS-DPC 處理地上部干物質(zhì)質(zhì)量與CK-DPC 相比下降62%，DPC 處理與清水對(duì)照相比降幅減少了9.0 百分點(diǎn)（圖1B）。

無(wú)論供水條件如何，與清水對(duì)照相比，噴施DPC 對(duì)地下部根系干物質(zhì)質(zhì)量無(wú)顯著影響。干旱脅迫7 d 后，DS-Ctrl 處理的根系干物質(zhì)質(zhì)量較CK-Ctrl 降低14%；與CK-DPC 相比，DS-DPC 處理的根系干物質(zhì)質(zhì)量降低11%；DPC 處理與清水對(duì)照處理相比， 根系干物質(zhì)質(zhì)量降幅減少了3.0 百分點(diǎn)（圖1C）。 說(shuō)明DPC 處理能夠緩解干旱對(duì)棉花幼苗的生長(zhǎng)抑制，且對(duì)地上部的緩解作用更明顯。

圖1 噴施DPC 對(duì)干旱脅迫下棉苗生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effects of spraying DPC on the development of cotton seedlings under drought stress

2.2 DPC 對(duì)棉苗葉片相對(duì)含水量的影響

正常供水條件下，CK-DPC 處理的棉花幼苗葉片相對(duì)含水量與CK-Ctrl 處理無(wú)顯著差異。 脅迫條件下，DS-DPC 處理的葉片相對(duì)含水量較DS-Ctrl 顯著增加12.06%（圖2）， 表現(xiàn)出較強(qiáng)的保水能力。

圖2 噴施DPC 對(duì)棉苗葉片相對(duì)含水量的影響Fig. 2 Effects of spraying DPC on the relative water content of cotton leaves

2.3 噴施DPC 對(duì)干旱脅迫下葉片脯氨酸含量的影響

脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[23]，干旱脅迫下，DS-Ctrl 處理的脯氨酸含量較CK-Ctrl 處理有所增加；DS-DPC 處理的脯氨酸含量較CK-DPC有所增加。 除干旱處理6 d 后， 在不同供水條件下，DPC 處理組的脯氨酸含量較清水處理組均有所增加（圖3）。 CK-DPC 處理的脯氨酸含量在第2 天和第4 天分別較CK-Ctrl 顯著增加53.9%和79.0%。 脅迫條件下，DS-DPC 處理的脯氨酸含量在第1 天和第2 天分別較DS-Ctrl 顯著增加84.3%和58.8%。 上述研究結(jié)果表明DPC 可以通過(guò)促進(jìn)棉花幼苗中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累來(lái)應(yīng)答干旱脅迫。

圖3 噴施DPC 對(duì)干旱脅迫下葉片脯氨酸含量的影響Fig. 3 Effects of spraying DPC on proline content in leaf under drought stress

2.4 各處理下DPC 對(duì)棉花幼苗光合特性的影響

正常供水條件下，CK-DPC 處理增加了葉片的葉綠素含量，但與CK-Ctrl 相比差異不顯著。干旱脅迫5 d 后，DS-Ctrl 處理的葉片葉綠素含量與CK-Ctrl 相比顯著下降，降幅為30.7%；而DS-DPC處理緩解了干旱脅迫對(duì)葉綠素的破環(huán)， 與CK-DPC處理相比降幅為18.9%， 且與CK-Ctrl 相比無(wú)顯

著性差異（圖4A）。

正常供水條件下，CK-DPC 處理的幼苗葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）與CK-Ctrl 相比均無(wú)顯著差異（圖4B～E）。 干旱脅迫后，相較DS-Ctrl 處理，DS-DPC 處理的Pn和Tr分別顯著增加149.1%和85.9%，Ci顯著降低18.0%，Gs有所增加，但無(wú)顯著性差異。

2.5 噴施DPC 提高干旱脅迫下棉花幼苗水分利用率

正常供水條件下，CK-DPC 處理的水分利用率較CK-Ctrl 處理無(wú)顯著差異。 干旱脅迫5 d 后，DS-Ctrl 處理的水分利用率較CK-Ctrl 顯著下降，DS-DPC 處理的水分利用率較DS-Ctrl 顯著增加67%， 且與CK-DPC 處理組相比無(wú)顯著差異（圖4F）。

圖4 噴施DPC 對(duì)棉花幼苗光合參數(shù)的影響Fig. 4 Effects of spraying DPC on photosynthetic parameters of cotton seedlings

2.6 各處理下DPC 對(duì)棉苗葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖5 可見(jiàn)， 無(wú)論供水條件如何，DPC 處理均可增加葉片中可溶性蛋白含量。 實(shí)施干旱脅迫的第2 天，CK-DPC 處理的可溶性蛋白含量較CK-Ctrl 顯著增加62.6%。DS-DPC 處理的可溶性蛋白含量在第1 天和第2 天分別較DS-Ctrl 顯著增加192.7%和28.2%。

圖5 噴施DPC 對(duì)干旱脅迫下棉花葉片可溶性蛋白含量的影響Fig. 5 Effects of spraying DPC on soluble protein content of cotton seedlings under drought stress

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫條件下， 葉面噴施DPC可顯著提高棉花幼苗的相對(duì)含水量、凈光合速率和水分利用率，可通過(guò)調(diào)節(jié)水分平衡和光合性能增強(qiáng)棉花抵御干旱脅迫的能力。

3.1 DPC 處理降低干旱脅迫造成的地上部干物質(zhì)損失

干旱脅迫可嚴(yán)重影響棉花的干物質(zhì)積累[24]。本研究中DS-Ctrl 和DS-DPC 處理的地上部干物質(zhì)質(zhì)量較正常供水處理均顯著減少， 但DS-DPC處理的地上部干物質(zhì)質(zhì)量下降程度小于DS-Ctrl（圖1B）。 Niakan 等[25]的研究結(jié)果表明，不同濃度的DPC 對(duì)棉花各部位干物質(zhì)質(zhì)量影響不同；噴施DPC 0.5～2.0 L·hm－2可顯著縮短植株的莖長(zhǎng)，但對(duì)地上部的生物量沒(méi)有顯著影響。 本研究中， 正常供水條件下噴施DPC 會(huì)降低棉花的株高（圖1A），這與DPC 處理植株中調(diào)節(jié)莖伸長(zhǎng)的GA 合成基因CPS和KS的表達(dá)水平及蛋白活性的結(jié)果一致[26-27]。 而在干旱脅迫條件下，由于植株啟動(dòng)抗逆應(yīng)答機(jī)制，生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，如干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄因子TINY 可平衡油菜素內(nèi)酯信號(hào)介導(dǎo)的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答[28]。 本研究中干旱處理抑制棉花幼苗地上部的生長(zhǎng)與前人研究結(jié)果一致， 而DPC 處理通過(guò)誘導(dǎo)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累、 增強(qiáng)植株葉片光合性能等緩解逆境脅迫，減輕脅迫對(duì)棉花地上部生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)， 表現(xiàn)為DPC 處理后地上部的干物質(zhì)損失較清水對(duì)照有所降低。

3.2 DPC 可緩解干旱對(duì)根系生物量的抑制作用

地下部根系是吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所，根系形態(tài)不同的棉花品種對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)不同[29]。Wu 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，200 mg·L－1DPC 浸種能顯著增加棉花萌發(fā)階段的側(cè)根數(shù)。 本研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施30 mg·L－1DPC 后第12 天對(duì)棉花幼苗根系沒(méi)有明顯影響，但緩解了干旱對(duì)根系生物量的抑制作用（圖1C）。 已有研究表明DPC 處理后10～15 d 為藥效高峰期， 且不同濃度DPC 對(duì)棉花根部發(fā)育的影響不一[31]。Niakan 等[25]用DPC 0.5～2.0 L·hm－2劑量處理棉花3 周后，發(fā)現(xiàn)其地上部株高受到顯著抑制，而根部的長(zhǎng)度與對(duì)照相比無(wú)顯著變化，這與本研究的結(jié)果相似。 推測(cè)本研究中DPC 對(duì)棉花根系形態(tài)無(wú)明顯調(diào)控作用的原因可能是藥劑處理后的時(shí)間較短且濃度較低。

3.3 干旱脅迫下DPC 處理調(diào)控棉花幼苗的水分保持與利用

水分脅迫條件下，植物地上部的高保水能力對(duì)維持胞內(nèi)水勢(shì)，保證各項(xiàng)生理機(jī)制的正常運(yùn)行具有重要意義[32]。 失水率能直接反映植物地上部的持水能力，可作為衡量作物抗旱性的重要指標(biāo)之一[33]。 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸等小分子化合物能夠提高作物的滲透調(diào)節(jié)能力，維持胞內(nèi)水勢(shì)穩(wěn)定以防止細(xì)胞過(guò)度失水[34]。干旱條件下，植物葉片中的脯氨酸含量可短時(shí)間增加200 倍[35]，一方面增強(qiáng)了細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)作用，另一方面其偶極性對(duì)膜蛋白起到了一定的保護(hù)作用[36]。 田又升等[37]研究發(fā)現(xiàn)耐旱型棉苗的脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因GhP5CS表達(dá)水平顯著增加，促進(jìn)脯氨酸的合成以應(yīng)對(duì)干旱。 本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫條件下葉面噴施DPC 能有效降低植株地上部的失水速率，減少水分散失；促進(jìn)植株體內(nèi)脯氨酸的積累，維持滲透平衡；提高葉片的相對(duì)含水量，增強(qiáng)棉花的耐旱性，減輕水分虧缺帶來(lái)的生理?yè)p傷。

水分利用率是評(píng)價(jià)作物耐旱性的一個(gè)重要指標(biāo)，受滲透調(diào)節(jié)、氣孔導(dǎo)度和光合作用等多種因素調(diào)控，可用來(lái)反映植物水分蒸散和光合作用之間的協(xié)調(diào)程度。 在玉米和小麥中的研究表明，耐旱性強(qiáng)的品種在干旱脅迫下具有較高的水分利用率[38-39]。本研究中，干旱脅迫7 d 后，棉花幼苗的Tr和Pn降低，但水分利用率較高。表明DPC 可優(yōu)化干旱脅迫下棉花幼苗的水分利用，從而提高棉花的耐旱性。

3.4 干旱脅迫下DPC 處理提高棉花幼苗的光合效率

光合作用對(duì)干旱脅迫非常敏感，當(dāng)葉片相對(duì)含水量低于80%時(shí)，凈光合作用將降低50%[40-41]。原因是一方面，干旱使葉綠素減少，葉綠體結(jié)構(gòu)功能退化，RUBP 羧化酶等光合作用酶的活性下降，抑制干物質(zhì)的生產(chǎn)與積累[40]；另一方面，干旱使氣孔關(guān)閉，阻礙CO2的同化進(jìn)程[41]。 干旱處理5 d 后棉花幼苗的葉綠素含量和凈光合速率顯著降低，葉片的光捕獲能力和碳同化能力下降。 噴施DPC 可使棉花葉片的葉綠素含量和光合速率增加， 但DPC 不同用量對(duì)不同品種的影響程度不一[42-43]。本研究中，在正常供水條件下噴施DPC后，葉綠素含量、凈光合速率均呈升高趨勢(shì)，但與對(duì)照相比無(wú)顯著性差異，分析原因可能與棉花品種、DPC 用量以及處理后的取樣時(shí)間有關(guān)。 干旱脅迫下DS-Ctrl 處理的胞間CO2濃度較CK-Ctrl處理升高、氣孔導(dǎo)度下降，推測(cè)凈光合速率的下降是內(nèi)部光合作用生理機(jī)能遭到破壞所致[43]。 與DS-Ctrl 處理相比，DS-DPC 處理葉片的總?cè)~綠素含量提高，胞間CO2濃度降低、氣孔導(dǎo)度升高，說(shuō)明DPC 減輕了干旱脅迫下非氣孔因素對(duì)光合速率的抑制效應(yīng)， 從而提高了葉片的光合速率，這與DPC 可以緩解干旱對(duì)地上部干物質(zhì)積累的影響一致。

3.5 干旱脅迫下DPC 處理提高棉花幼苗的可溶性蛋白含量

葉片中大部分可溶性蛋白是與光合作用相關(guān)的CO2固定酶[45]和逆境蛋白[46-47]。 因干旱脅迫下光合速率顯著下降，推測(cè)本研究中可溶性蛋白含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)（脅迫后1～4 d）而增加的現(xiàn)象與逆境蛋白的積累有關(guān)。 逆境蛋白可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因表達(dá)，幫助植物適應(yīng)不利的生長(zhǎng)環(huán)境[48]。 本研究中，DPC 處理增加了葉片可溶性蛋白的積累， 說(shuō)明DPC 可能通過(guò)促進(jìn)逆境蛋白合成增強(qiáng)細(xì)胞在干旱脅迫下的保護(hù)能力。

4 結(jié)論

正常供水條件下， 葉面噴施DPC 對(duì)棉花幼苗的相對(duì)含水量、總?cè)~綠素含量、凈光合速率及水分利用率無(wú)顯著影響。 干旱脅迫下，DPC 處理能緩解地上部的水分散失、 增加葉片脯氨酸積累、顯著提高葉片相對(duì)含水量，增強(qiáng)葉片的保水能力；還可以提高葉片總?cè)~綠素含量、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和凈光合速率，增加葉片可溶性蛋白含量，提高水分利用率；綜上，DPC 可通過(guò)調(diào)節(jié)水分平衡和光合性能增強(qiáng)棉花的抗旱性。