棉花HDAC 基因家族鑒定及其在黃萎病菌侵染下的表達(dá)分析

王艷情，鄭杰，許艷超，蔡小彥，周忠麗，侯宇清，王坤波，王玉紅，陳浩東，劉方*，李志坤

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/ 華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng) 455000）

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)經(jīng)常受到黃萎病的影響[1]。 我國(guó)棉田中的黃萎病主要由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起[2]。 黃萎病也被稱(chēng)為棉花的“癌癥”[3]，棉株感染大麗輪枝菌后，葉片嚴(yán)重失綠，形成黃色病斑，造成減產(chǎn)甚至絕收[4]。棉屬（Gossypium）有4 個(gè)栽培棉種和49個(gè)野生棉種[5-6]。 栽培棉種對(duì)病蟲(chóng)害及非生物脅迫較為敏感，而野生棉種長(zhǎng)期生長(zhǎng)在惡劣的自然環(huán)境中， 具有豐富的遺傳多樣性與抗病蟲(chóng)害基因源[7]，是棉花遺傳改良的優(yōu)異資源。Dong 等[8]比較分析了瑟伯氏棉（Gossypium thurberi）、雷蒙德氏棉（G.raimondii）和三裂棉（G.trilobum）在大麗輪枝菌脅迫下的表型，發(fā)現(xiàn)瑟伯氏棉具有很強(qiáng)的黃萎病抗性。 因此，進(jìn)一步挖掘野生棉，特別是瑟伯氏棉中的抗病基因?qū)γ藁裹S萎病遺傳改良具有重要意義。

組蛋白去乙酰化酶 （Histone deacetylase，HDAC）通過(guò)降低染色體的乙酰化水平從而抑制轉(zhuǎn)錄[9]。 植物中HDAC 家族分為3 個(gè)亞家族，分別是RPD3/HDA1（Reduced potassium dependency 3/Histone deacetylase 1）、SIR2 （Silent information regulator 2）和HD2（Histone deacetylase 2）。 RPD3/HDA1 作為該家族最大的亞家族，成員具有典型的HDAC 結(jié)構(gòu)域[10]。 SIR2 又被稱(chēng)為Sirtuins，該亞族成員與其他HDAC 沒(méi)有結(jié)構(gòu)相似性，并且需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）作為輔助因子[11]。 HD2 亞家族成員主要有3 個(gè)結(jié)構(gòu)域：具有保守五肽序列的氮末端結(jié)構(gòu)域、高電荷的中央酸性結(jié)構(gòu)域和可變的碳末端結(jié)構(gòu)域[12]；HD2 首先在玉米中被鑒定，僅存在于植物中[13]。

近年來(lái)，在擬南芥[14]、水稻[15]和大豆[16]基因組中分別鑒定出18、17 和28 個(gè)HDAC家族基因，并發(fā)現(xiàn)其在植株生長(zhǎng)發(fā)育與響應(yīng)逆境脅迫中具有重要功能。 擬南芥中AtHDA6和AtHDA19均表現(xiàn)為促進(jìn)開(kāi)花[17]，而AtHDA9抑制開(kāi)花[18]。擬南芥AtHDA9過(guò)表達(dá)植株對(duì)鹽脅迫更加敏感；相反，hda9突變體植株對(duì)鹽脅迫的抗性增強(qiáng)[19]。 此外，HDAC 家族成員在病原菌防御中也起著關(guān)鍵作用，過(guò)表達(dá)AtHDAC19基因的擬南芥通過(guò)激活ERF1而增加病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis-related proteins，PRs）的表達(dá)增強(qiáng)植株的抗性，沉默該基因則導(dǎo)致植株對(duì)病原菌更加敏感[20]。

棉花GhHDT4D 通過(guò)調(diào)節(jié)GhWRKY33啟動(dòng)子區(qū)H3K9 乙酰化水平， 從而抑制GhWRKY33的表達(dá)，在應(yīng)對(duì)干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用[21]。 然而，HDAC 在棉花抗黃萎病方面的作用還未見(jiàn)報(bào)道。 本研究以棉花基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，鑒定并比較分析了陸地棉、亞洲棉和瑟伯氏棉中HDAC基因家族成員基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系及順式作用元件的差異，并結(jié)合瑟伯氏棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[8]和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）明確了在黃萎病菌侵染情況下GthHDAC家族基因的表達(dá)模式，研究結(jié)果為進(jìn)一步挖掘野生棉中優(yōu)異抗病基因提供了基礎(chǔ)，并為棉花抗病育種提供了新的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用的二倍體瑟伯氏棉（D1）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所野生棉課題組/ 國(guó)家種質(zhì)三亞野生棉圃提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1棉花HDAC 基因家族成員的鑒定。二倍體亞洲棉（G.arboreum，A2）和瑟伯氏棉、四倍體陸地棉（G. hirsutum，AD1）基因組數(shù)據(jù)來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所（http://cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp）。 按照李曉斐等[22]的方法從Pfam[23]（http://pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載HDAC結(jié)構(gòu)域（PF00850）、SRT 結(jié)構(gòu)域（PF02146），從TAIR（http://www.arabidopsis.org）網(wǎng)站下載擬南芥HD2 的氨基酸序列后，以PF00850、PF02146以及HD2 的序列為種子序列，利用本地Blast 搜索3個(gè)棉種的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，得到候選HDAC 家族蛋白序列。 通過(guò)在線網(wǎng)站Pfam、NCBI CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.sg）網(wǎng)站驗(yàn)證候選HDAC 蛋白中的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.2基因結(jié)構(gòu)、保守基序和順式作用元件分析。HDAC家族基因的基因結(jié)構(gòu)信息，包括開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）長(zhǎng)度、蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、外顯子數(shù)均從棉花功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cottonfgd.org/）獲得。 使用MEME（http://memesuite.org/）在線網(wǎng)站分析家族成員的保守基序，并使用TBtools[24]軟件對(duì)其進(jìn)行可視化處理。 使用ExPaSyServer（http://web.expasy.org/computer_pi） 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。 使用TBtools 軟件獲得HDAC基因起始密碼子上游的2 000 bp 序列， 然后將獲得的序列提交數(shù)據(jù)庫(kù)PlantCARE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html），預(yù)測(cè)其中的順式作用元件。

1.2.3染色體分布和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。 根據(jù)HDAC家族成員的基因ID，使用TBtools 軟件在3 個(gè)棉種的基因組注釋文件中進(jìn)行搜索， 以確定HDAC基因的染色體位置信息并對(duì)其進(jìn)行可視化處理。 使用在線工具TargetP 1.1（http://www.cds.dtu.dk/services/TargetP）對(duì)HDAC基因編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，并通過(guò)WoLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/） 網(wǎng)站中植物模式進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4系統(tǒng)發(fā)育分析。為了更好地了解HDAC基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系， 從TAIR 網(wǎng)站下載擬南芥HDAC基因家族的蛋白質(zhì)序列，與鑒定出的陸地棉、亞洲棉和瑟伯氏棉中HDAC基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。 利用MEGA X[25]軟件，采用最大似然法（Maximum likelihood method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap 值設(shè)為1 000，其余參數(shù)均為默認(rèn)值。

1.2.5脅迫處理。 瑟伯氏棉幼苗長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)，采用傷根法[25]接種大麗輪枝菌，取接種后0 h、24 h、48 h 的根、莖、葉于液氮速凍，放入超低溫冰箱（－80 ℃）保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。 每個(gè)處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

在棉花兩葉一心期分別使用5 mg·L－1乙烯（Ethylene, ET）、10 μmol·L－1茉莉酸（Jasmonic acid,JA） 和10 μmol·L－1水楊酸 （Salicylic acid,SA）均勻地噴施在葉片上，在處理后0 h、6 h、12 h和48 h 收集根、莖、葉。所有樣品在液氮速凍后放入超低溫冰箱（－80 ℃）保存，用于后續(xù)基因表達(dá)分析。 每個(gè)處理設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6瑟伯氏棉HDAC 基因家族抗病表達(dá)模式分析。 基于大麗輪枝菌脅迫下瑟伯氏棉根、莖、葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)， 將HDAC家族基因的表達(dá)量用FPKM（Fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）值表示，經(jīng)log2（1＋FPKM）標(biāo)準(zhǔn)化處理， 采用TBtools 軟件繪制熱圖并進(jìn)行歸一化處理，最終得到HDAC家族成員的熱圖。

1.2.7RNA 提取和qRT-PCR。 采用RNAprep Pure Plant Plus Kit 提取試劑盒提取樣品RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳以及分光光度計(jì)檢測(cè)樣品質(zhì)量。使用TranScript-All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得每個(gè)樣品的cDNA。 使用Primer Premier 5 設(shè)計(jì)GthHDAC家族基因的特異性引物（表1），以棉花GthUBQ7（Genebank：No. AY189972） 作為內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR 分析，按照2－ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[26]，每組數(shù)據(jù)來(lái)自3個(gè)生物學(xué)重復(fù)以及3 次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花HDAC 家族基因的鑒定

在陸地棉、亞洲棉以及瑟伯氏棉中分別鑒定出30、15 和13 個(gè)HDAC基因， 按照其在染色體上的位置分別命名為GhHDAC1～GhHDAC30、GaHDAC1～GaHDAC15、GthHDAC1～GthHDAC13（附表1～3）。

理化性質(zhì)分析顯示，3 個(gè)棉種HDAC家族成員的ORF 序列差異較大，長(zhǎng)度從480 到2 100 bp，大多數(shù)為1 000～2 000 bp。陸地棉HDAC基因的平均外顯子長(zhǎng)度 （212.62 bp） 明顯大于亞洲棉（145.88 bp）和瑟伯氏棉（138.21 bp）HDAC基因（圖1A）； 亞洲棉HDAC成員的平均內(nèi)含子長(zhǎng)度大于陸地棉和瑟伯氏棉HDAC家族基因 （圖1B）；瑟伯氏棉HDAC家族成員的外顯子數(shù)量與亞洲棉和陸地棉HDAC 家族成員的外顯子數(shù)量差異較大，而亞洲棉和陸地棉間無(wú)明顯差異（圖1C）；3 個(gè)棉種的HDAC基因ORF 的GC 含量差異較小，在40%～48%（圖1D）。 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，3 個(gè)棉種大多數(shù)HDAC 蛋白定位在細(xì)胞核中，部分定位在細(xì)胞質(zhì)，個(gè)別定位于線粒體和葉綠體（附表1～3）。

圖1 3 個(gè)棉種中HDAC 家族基因結(jié)構(gòu)分析Fig. 1 Structural analysis of HDAC genes in three Gossypium species

表1 qRT-PCR 所用引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

2.2 棉花HDAC 家族基因的染色體分布

根據(jù)亞洲棉、瑟伯氏棉以及陸地棉的基因組注釋信息， 對(duì)58 個(gè)HDAC基因進(jìn)行了染色體分布分析。由結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，亞洲棉HDAC家族的15 個(gè)成員分布在9 條染色體上，其中在Chr13 染色體上有較多的分布，分別是GaHDAC13、GaHDAC14和GaHDAC15。 陸地棉30 個(gè)GhHDAC基因分布在17 條染色體上，每條染色體上有1～3 個(gè)GhHDAC基因；瑟伯氏棉的13 個(gè)GthHDAC基因分布在8 條染色體上，每條染色體上有1～3 個(gè)基因， 其中13 號(hào)染色體上最多， 分別是GthHDAC11、GthHDAC12和GthHDAC13。

圖2 3 個(gè)棉種HDAC 基因的染色體分布Fig. 2 Chromosome distribution of HDAC genes in three Gosspium species

2.3 HDAC 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了探究HDAC基因的進(jìn)化規(guī)律，將3 個(gè)棉種中的HDAC 蛋白與擬南芥HDAC 蛋白共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3），結(jié)果顯示，3 個(gè)棉種和擬南芥中的HDAC 蛋白在RPD3/HDA1、HD2 和SIR2 亞族均有分布， 表明HDAC 蛋白在棉花和擬南芥不同物種間具有保守性。

圖3 陸地棉、亞洲棉、瑟伯氏棉和擬南芥中HDAC 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of HDAC proteins in three Gosspium species and Arabidopsis thaliana

2.4 棉花HDAC 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及其保守基序分析

保守基序及結(jié)構(gòu)域分析（圖4）顯示，SIR2 中的保守基序?yàn)閙otif3、motif9；RPD3/HDA1 的保守基序最多， 分別是motif1、motif2、motif4、motif5、motif6、motif7、motif8 和motif10；HD2 中的成員僅含有motif10。 由此可見(jiàn)，同一亞族成員含有相同的保守基序， 推測(cè)它們可能具有相似功能，不同亞組間的保守基序差異較大，推測(cè)在不同亞族的HDAC 蛋白可能存在功能差異。

圖4 3 個(gè)棉種HDAC 的結(jié)構(gòu)分析Fig. 4 Structural analysis of HDAC proteins in three Gossipium species

2.5 順式作用元件分析

順式作用元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，HDAC基因的啟動(dòng)子區(qū)域有大量與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的順式作用元件 （圖5）， 如生長(zhǎng)素反應(yīng)元件（AuxRR-core，TGA-element）、分生組織表達(dá)相關(guān)的元件、胚乳表達(dá)相關(guān)的元件、MYB 反應(yīng)元件。 其中，MYB 反應(yīng)元件含量最多，GaHDAC基因中有120 個(gè)，GhHDAC基因中有217 個(gè)，GthHDAC基因中有125 個(gè)。 此外，在棉花HDAC基因的啟動(dòng)子中還發(fā)現(xiàn)了一些與激素反應(yīng)相關(guān)的元件，例如脫落酸反應(yīng)元件（ABRE）、茉莉酸甲酯反應(yīng)元件（CGTCA-motif 和TGACG-motif）、SA 反應(yīng)元件（TCA-element）。還發(fā)現(xiàn)了一些與脅迫相關(guān)的順式作用元件，分別是干旱響應(yīng)元件（MBS）、低溫響應(yīng)元件（LTR）、應(yīng)急應(yīng)答元件（TC-rich repeats）以及一些響應(yīng)病原體的順式作用元件（W-box，G-box，as-1 element 和P-box）等。

圖5 棉花HDAC 基因的順式作用元件分析Fig. 5 Cis-acting elements analysis of HDAC genes in cotton

2.6 瑟伯氏棉HDAC 基因家族在大麗輪枝菌脅迫下的表達(dá)模式分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明， 瑟伯氏棉中13 個(gè)GthHDAC基因在黃萎病菌脅迫下具有不同的時(shí)空表達(dá)模式（圖6）。黃萎病菌脅迫后12 h，大部分GthHDAC基因在葉片中差異表達(dá)，其中GthHDAC1、GthHDAC2、GthHDAC6、GthHDAC8、GthHDAC9、GthHDAC10、GthHDAC12和GthHDAC13上調(diào)表達(dá)，GthHDAC3、GthHDAC4、GthHDAC5和GthHDAC7下調(diào)表達(dá)， 說(shuō)明GthHDAC基因可能在棉花抵御黃萎病菌中發(fā)揮作用。 有趣的是， 在黃萎病脅迫下，GthHDAC11在根和莖中高水平表達(dá)；而在黃萎病菌脅迫后48 h，在葉片中出現(xiàn)一定程度的上調(diào)表達(dá)，主要在莖和葉中表達(dá)。 在黃萎病菌脅迫后12 h，GthHDAC7在莖和葉中下調(diào)表達(dá)；48 h 時(shí)其在莖中表達(dá)量提升，但在葉片中依然下調(diào)表達(dá)。

圖6 黃萎病菌脅迫下GthHDAC 基因轉(zhuǎn)錄組分析Fig. 6 Transcriptome analysis of GthHDAC genes under V. dahliae stress

利用qRT-PCR 技術(shù)進(jìn)一步分析GthHDAC基因在黃萎病菌侵染后0 h、24 h 和48 h 的表達(dá)模式（圖7）。 黃萎病菌侵染后，幾乎所有GthHDAC基因在葉片中上調(diào)表達(dá)，GthHDAC4、GthHDAC7、GthHDAC11和GthHDAC12在侵染后24 h 和48 h 上調(diào)表達(dá)倍數(shù)均較高。 黃萎病菌侵染后24 h，GthHDAC7和GthHDAC13在根中顯著下調(diào)表達(dá)；GthHDAC4、GthHDAC7和GthHDAC10在莖中上調(diào)表達(dá)，GthHDAC1、GthHDAC2、Gth-HDAC3、GthHDAC5、GthHDAC8、GthHDAC11、GthHDAC12和GthHDAC13在莖中下調(diào)表達(dá)。其中：GthHDAC4在黃萎病菌侵染后24 h 在根中下調(diào)表達(dá)，48 h 時(shí)上調(diào)表達(dá)； 黃萎病菌侵染后GthHDAC7在根中下調(diào)表達(dá)，在葉片上調(diào)表達(dá)。

圖7 黃萎病菌脅迫下GthHDAC 基因在棉花不同組織的表達(dá)分析Fig. 7 Expression analysis of GthHDAC genes in different cotton tissues under V. dahliae stress

從響應(yīng)大麗輪枝菌侵染的瑟伯氏棉HDAC基因家族成員中隨機(jī)挑選GthHDAC4、GthHDAC5、GthHDAC11和GthHDAC13四個(gè)基因，分析其在不同激素處理下的表達(dá)模式 （圖8）。GthHDAC4基因在ET 處理下表達(dá)水平逐漸上升， 在處理后48 h 達(dá)到峰值；SA 處理后48 h 表達(dá)量最高；JA 處理后12 h 達(dá)到峰值， 超過(guò)對(duì)照20 多倍。GthHDAC5基因的表達(dá)量在ET 處理后6 h 達(dá)到峰值；SA 處理后48 h，GthHDAC5表達(dá)量逐漸達(dá)到最高；JA 處理后12 h，GthHDAC5的表達(dá)量達(dá)到峰值。GthHDAC11和GthHDAC13基因的表達(dá)量在ET、SA 和JA 處理后6 h 達(dá)到峰值， 隨后降低。 上述結(jié)果表明， 瑟伯氏棉中GthHDAC基因?qū)S萎病菌侵染產(chǎn)生應(yīng)答， 并且其行使功能可能與ET、SA 和JA 等信號(hào)通路有關(guān)。

圖8 不同激素處理下GthHDAC 基因的表達(dá)Fig. 8 Expression of GthHDAC genes under different hormone treatments

3 討論

組蛋白乙酰化修飾通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄在植物發(fā)育和抵御病原菌侵染中發(fā)揮重要作用，而HDAC 介導(dǎo)的去乙酰化是組蛋白乙酰化修飾中重要的一環(huán)[27]。 四倍體陸地棉（AADD）是由A 基因組供體棉種與D 基因組供體棉種通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交形成的，亞洲棉屬于A 基因組棉種，具有較強(qiáng)的黃萎病抗性[28-32]。 瑟伯氏棉是D 基因組棉種中的抗黃萎病的棉種[26]。 因此，研究亞洲棉、瑟伯氏棉和陸地棉HDAC基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，有利于加深對(duì)HDAC基因家族的進(jìn)化及其在黃萎病抗性中的作用的認(rèn)識(shí)。

本研究在陸地棉、亞洲棉以及瑟伯氏棉中分別鑒定出30、15 和13 個(gè)HDAC基因。GthHDAC基因成員數(shù)量與GaHDAC基因的成員數(shù)量之和近似于GhHDAC家族基因成員數(shù)量， 這一結(jié)果進(jìn)一步印證了Beasley[33]關(guān)于四倍體種結(jié)合了A染色體組和D 染色體組的遺傳物質(zhì)這一觀點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，3 個(gè)棉種和擬南芥中的HDAC基因親緣關(guān)系較近，表明HDAC基因家族在進(jìn)化上高度保守。

HDAC 通過(guò)影響植物激素合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中相關(guān)基因的組蛋白乙酰化水平，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)量，從而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)等過(guò)程[22]。本研究發(fā)現(xiàn)在HDAC基因的啟動(dòng)子區(qū)域富含多種激素反應(yīng)元件， 如SA 脅迫響應(yīng)元件、JA 脅迫響應(yīng)元件、 脫落酸脅迫響應(yīng)元件等。 擬南芥AtHDA6 通過(guò)與F-box 元件相互作用進(jìn)而參與到JA 信號(hào)通路， 在植株抵抗病原菌過(guò)程中發(fā)揮作用[17]；AtHDA19基因可以被ET 和JA 誘導(dǎo)， 過(guò)表達(dá)該基因可以誘導(dǎo)ERF1以及JA調(diào)控的病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)擬南芥對(duì)蕓薹生鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）的抗性[20]。 本研究中，在ET、SA 和JA 的處理下，GthHADC4、GthHADC5、GthHADC11和GthHADC13這4 個(gè)基因均不同程度上調(diào)表達(dá)，這些結(jié)果表明GthHDAC基因可能參與了ET/JA和SA 信號(hào)通路，進(jìn)而參與到棉花黃萎病抗性反應(yīng)。

Brosch 等[34]發(fā)現(xiàn)玉米與圓斑病菌之間的相互作用可以抑制寄主HDAC 的活性，即HC 毒素通過(guò)抑制HDAC的表達(dá)充當(dāng)誘導(dǎo)子，激活防御反應(yīng)。 本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和qRT-PCR 分析驗(yàn)證了瑟伯氏棉HDAC基因家族成員在黃萎病菌脅迫下的表達(dá)譜。 但在2 種分析方式下HDAC基因的表達(dá)量存在一定差異，可能是因?yàn)閮烧弑磉_(dá)量的計(jì)算方式不同。 其中GthHDA1、GthHDAC3、GthHDAC11和GthHDAC12基因顯著上調(diào)表達(dá)，這些基因大多屬于RPD3/HDA1 亞家族。 在擬南芥中，RPD3/HDA1 型HDAC基因（HDA19和HDA6）可能在ET 和JA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和病原體反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[17]。此外，鄧琴霖等[35]發(fā)現(xiàn)RPD3/HDA1 家族成員可調(diào)控植物逆境應(yīng)答， 推測(cè)GthHDAC家族基因中RPD3/HDA1 亞組成員可能參與植物對(duì)黃萎病的防御。

4 結(jié)論

通過(guò)全基因組分析，在陸地棉、亞洲棉和瑟伯氏棉中分別鑒定出30、15 和13 個(gè)HDAC家族基因。 通過(guò)進(jìn)化關(guān)系分析，將其分為3 個(gè)亞家族。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，大部分HDAC 定位于細(xì)胞核。 表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，在黃萎病菌脅迫下，大多數(shù)瑟伯氏棉GthHDAC基因在葉片中上調(diào)表達(dá)，并且受ET、SA 和JA 的誘導(dǎo)。 本研究通過(guò)解析陸地棉、亞洲棉和瑟伯氏棉中HDAC基因的進(jìn)化規(guī)律，明確了不同激素處理下HDAC基因在瑟伯氏棉中的表達(dá)模式，為研究HDAC 在抵御棉花黃萎病中的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

附表：

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附表1 亞洲棉HDAC家族的理化性質(zhì)

Table S1 Physicochemical properties ofHDACgenes inG.arboreum

附表2 陸地棉HDAC家族的理化性質(zhì)

Table S2 Physicochemical properties ofHDACgenes inG.hirsutum

附表3 瑟伯氏棉HDAC的理化性質(zhì)

Table S3 Physicochemical properties ofHDACgenes inG.thurberi