miR-105-5p靶向XAF1抑制宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制

艾恒玲 苗慧 趙歡 陳佳權(quán) (牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江 牡丹江 157000)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，靶向治療是其治療方式之一〔1〕。micoRNA(miRNA)在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要功能，且大量研究證實(shí)miRNAs在宮頸癌的轉(zhuǎn)移和分化中扮演重要角色，可用作宮頸癌靶向治療的靶標(biāo)〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-105在胃癌組織中明顯高表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其細(xì)胞活力、遷移能力，抑制其凋亡〔3〕。miR-105過(guò)表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞G0/G1期阻滯，抑制肝癌細(xì)胞增殖〔4〕。在篩選差異表達(dá)miRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-105-5p在宮頸癌細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)〔5〕，但其對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲等生物行為的影響及其機(jī)制目前還不清楚。XAF1是促凋亡的腫瘤抑制因子，拮抗X-連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)抗細(xì)胞凋亡作用的蛋白，在多種人類癌癥中失活或下調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá)XAF1可誘導(dǎo)凋亡、抑制增殖〔6〕。XAF1在宮頸癌組織中下調(diào)表達(dá)，促進(jìn)其表達(dá)會(huì)抑制宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔7〕。本文旨在研究miR-105-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其機(jī)制是否與XAF1有關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料 宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa和正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；Transwell小室、Matrigel購(gòu)于美國(guó)BD公司；RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa和正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞HeLa，將其分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-105a-5p組(轉(zhuǎn)染miR-105a-5p mimics)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、anti-miR-105a-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-105a-5p)、pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-XAF1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-XAF1)、anti-miR-105a-5p+si-NC組(共轉(zhuǎn)染anti-miR-105a-5p和si-NC)、anti-miR-105a-5p+ si-XAF1組(共轉(zhuǎn)染anti-miR-105a-5p和si-XAF1)。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)miR-105a-5p和XAF1 mRNA表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.3Western印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá) 提取總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用脫脂奶粉封閉后，分別加入一抗和二抗孵育，然后進(jìn)行顯影、定影，檢測(cè)蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.2.4Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell小室接種細(xì)胞，下室加入含血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，擦去上層細(xì)胞，甲醛固定、結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell上室平鋪Matrigel，其余同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.5熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-105-5p對(duì)XAF1的靶向調(diào)控 構(gòu)建野生型和突變型XAF1的3′UTR熒光素酶表達(dá)載體(WT-XAF1和MUT-XAF1)，將其分別與miR-NC和miR-105-5p共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中；依據(jù)說(shuō)明書(shū)要求檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.00軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-105-5p在宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa和正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7中的表達(dá) 與正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7(0.16±0.01)相比，宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa中miR-105-5p的表達(dá)水平顯升高(0.89±0.09、0.42±0.04，F(xiàn)=251.449，P=0.000)。

2.2抑制miR-105-5p表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-105a-5p組宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低，MMP-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖1，表1。

圖1 抑制miR-105-5p表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

2.3miR-105-5p靶向、調(diào)控XAF1 TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示XAF1與miR-105-5p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。miR-105-5p與WT-XAF1轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；miR-105-5p與MUT-XAF1轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性差異不顯著，見(jiàn)表2。與miR-NC組比較，miR-105-5p組XAF1表達(dá)水平顯著降低，與anti-NC組比較，anti-miR-105-5p組XAF1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3，表3。

圖2 Western印跡檢測(cè)XAF1的3′UTR含有miR-105-5p的互補(bǔ)序列

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：MiR-NC組、miR-105a-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-105a-5p組圖3 Western印跡檢測(cè)XAF1蛋白的表達(dá)

表3 miR-105a-5p調(diào)控XAF1的表達(dá)

2.4過(guò)表達(dá)XAF1對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-XAF1組宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)，MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，XAF1和E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表4，圖4。

圖4 過(guò)表達(dá)XAF1對(duì)宮頸癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

2.5抑制XAF1表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-105-5p表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲的作用 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-105a-5p組宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低，MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低，XAF1和E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與anti-miR-105a-5p+si-NC組相比，anti-miR-105a-5p+ si-XAF1組宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高，MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，XAF1和E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5，表5。

1～4：Anti-miR-NC組、anti-miR-105a-5p組、anti-miR-105a-5p+si-NC組、atin-miR-105a-5p+si-XAF1組圖5 抑制XAF1表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-105-5p表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二大女性惡性腫瘤，雖然手術(shù)、放化療等治療方式已延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，改善患者的生存質(zhì)量，但臨床上對(duì)于晚期和復(fù)發(fā)型宮頸癌的治療仍較為棘手分子水平上的靶向治療可達(dá)到提高療效、減少毒副作用的目的〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)miRNA影響宮頸癌的進(jìn)展，研究miRNA有利于宮頸癌的早期診斷治療及預(yù)后評(píng)估〔9〕。miR-105通過(guò)MYC依賴的基質(zhì)細(xì)胞代謝促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)〔10〕；miR-105通過(guò)下調(diào)SFRP1激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的干性，化學(xué)抗性和轉(zhuǎn)移〔11〕。miR-105在結(jié)直腸癌中的上調(diào)與侵襲性表型相關(guān)，miR-105表達(dá)參與TNF-α誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)〔12〕。miR-105的表達(dá)在胃癌組織中降低，miR-105的過(guò)表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖和進(jìn)展〔13〕。在本實(shí)驗(yàn)中，miR-105a-5p在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)升高，抑制miR-105a-5p表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲，抑制MMP-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin蛋白的表達(dá)。

XAF1是一種抑癌基因，是XIAP最強(qiáng)的抑制因子，參與多種腫瘤的進(jìn)展。研究其在腫瘤中的作用機(jī)制，對(duì)相關(guān)癌癥的治療具有重要意義，可作為分子靶向治療的靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)XAF1非小細(xì)胞肺癌中下調(diào)表達(dá)〔14〕；XAF1在口腔鱗癌組織中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)XAF1抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔15〕；Xaf1抑制表達(dá)會(huì)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡〔16〕。XAF1與IRF-1形成正反饋環(huán)，增加了應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并降低了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力〔16〕。沉默HS6ST3通過(guò)誘導(dǎo)XAF1來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和進(jìn)展〔17〕。內(nèi)毒素刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量IFNβ，而IFNβ通過(guò)增加X(jué)AF1的表達(dá)誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞凋亡〔18〕。XAF1在宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌組織中低表達(dá)，與宮頸鱗癌癌變相關(guān)〔19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)XAF1可抑制宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲，抑制MMP-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin蛋白的表達(dá)。且miR-105a-5p靶向負(fù)調(diào)控XAF1，抑制XAF1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-105a-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，抑制miR-105a-5p表達(dá)可能通上調(diào)XAF1抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。