miR-214-5p調控HOXA13抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞炎癥反應及纖維化

彭君 彭家清 秦鵬 羅先榮 張敏 (荊州市中心醫院腎內科，湖北 荊州 434020)

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，長期的代謝紊亂及高血糖狀態易引起心血管、腎、神經系統等損害及功能障礙，導致糖尿病腎病(DN)等并發癥〔1〕。DN是糖尿病最常見的微血管并發癥，其致病機制涉及活性氧(ROS)的產生、晚期糖基化終末產物(AGE)的積累及蛋白激酶(PK)C等細胞內信號分子的活化等，但其具體機制仍未詳細闡明〔2〕。DN是導致終末期腎臟病的主要原因，其主要危險因素包括高血糖、高血壓和遺傳易感性，根據其病理特征和演變過程可將其分為5期，早期DN采用阻斷多元醇通路、抑制炎癥遞質產生和蛋白激酶C通路及晚期糖基化或非糖基化等治療方法可逆轉腎臟損害，延緩病理進程；而Ⅳ期或Ⅴ期，腎功能將持續性減退甚至衰竭〔3,4〕。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為18～22 nt的內源性非編碼RNA分子，通過與靶mRNA 3′非編碼區特異性結合可調節基因表達，參與細胞生長、分化、胚胎發育、免疫應答等生物過程〔5〕。已有研究〔6〕表明，miR-133b，miR-342和miR-30a在2型DN患者尿液中高表達，其表達水平與收縮壓-舒張壓、低密度脂蛋白、腎小球濾過率等有關，可作為2型DN的生物標志物。而miR-214已被證實在糖尿病小鼠腎皮質中表達上調，抑制miR-214可減弱腎小球肥大及系膜擴張〔7〕。本研究就miR-214-5p表達水平對高糖誘導的HMC細胞炎癥反應及纖維化的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1材料 HMC細胞(批號：4200)購自美國Science Cell公司；胎牛血清(批號：SH41288)、RPMI1640培養液(批號：SH30807)購自美國Gibco-BRL公司；D-葡萄糖(批號：MB2510)購自大連美侖生物科技公司；Lipofectamine 2000轉染試劑(批號：11668027)購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑(批號：15596)、RIPA裂解液(批號：R0020)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(批號：BSP0161)、電化學發光(ECL)液(批號：PE0030)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(批號：D0010)購自北京Solarbio公司；對照(control)小干擾RNA(siRNA)、同源盒蛋白(HOXA)13 siRNA由山東維真生物科技有限公司設計合成；HOXA13過表達載體(pcDNA-HOXA13)由金瑞斯生物科技公司構建；TaKaRa反轉錄試劑盒(批號：RR047A)、TaKaRa實時熒光定量試劑盒(批號：RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司；miR-214-5p熒光定量引物購自TaqMan公司；control抑制劑(inhibitors)、miR-214-5p inhibitors、control模擬物(mimics)、miR-214-5p mimics由上海吉瑪公司設計合成；兔抗HOXA13(批號：ab106503)、細胞間黏附分子(ICAM)-1(批號：ab53013)、骨形態發生蛋白(BMP)7(批號：ab27569)、纖維連接蛋白(FN)(批號：ab2413)、β-肌動蛋白(β-actin)(批號：ab8227)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(批號：ab6721)購自英國Abcam公司；Forma TM Steri-cycle TM i160 CO2細胞培養箱購自美國Thermo公司；Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀購自上海創萌生物科技有限公司；CFX96 Touch TM熒光定量PCR檢測系統、ChemiDoc TM MP凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞培養與分組 使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養HMC細胞，每天更換新鮮培養液。取對數生長期的細胞，胰酶消化后重懸，以6×103個/孔接種于96孔板，待細胞生長至匯合度約45%，按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書分別將control inhibitors、miR-214-5p inhibitors、control mimics、miR-214-5p mimics、pcDNA空載體、pcDNA-HOXA13、miR-214-5p inhibitors和control siRNA、miR-214-5p inhibitors和HOXA13 siRNA轉染至HMC細胞；將細胞分為NG組、HG組、Control組、anti-miR-con組、anti-miR-214-5p組、HG+anti-miR-con組、HG+anti-miR-214-5p組、HG+pcDNA組、HG+pcDNA-HOXA13組、HG干預(anti-miR-con、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-5p+pcDNA、anti-miR-214-5p+pcDNA-HOXA13)組。

處理方法：NG組(含5 mmol/L D-葡萄糖的培養液培養48 h)；HG組(含30 mmol/L D-葡萄糖的培養液培養48 h)；Control組(常規培養)；anti-miR-con組(轉染control inhibitors)；anti-miR-214-5p組(轉染miR-214-5p inhibitors)；HG+anti-miR-con組(轉染control inhibitors后以30 mmol/L D-葡萄糖處理48 h)；HG+anti-miR-214-5p組(轉染miR-214-5p inhibitors后30 mmol/L D-葡萄糖處理48 h)、HG+pcDNA組(轉染pcDNA后30 mmol/L D-葡萄糖處理48 h)；HG+pcDNA-HOXA13組(轉染pcDNA-HOXA13后30 mmol/L D-葡萄糖處理48 h)；HG干預(anti-miR-con、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-5p+pcDNA、anti-miR-214-5p+pcDNA-HOXA13)組(分別轉染control inhibitors、miR-214-5p inhibitors、miR-214-5p inhibitors+pcDNA、miR-214-5p inhibitors+pcDNA-HOXA13后30 mmol/L D-葡萄糖48 h)。

1.3RT-qPCR 收集NG組、HG組、Control組、anti-miR-con組和anti-miR-214-5p組細胞，充分研磨，Trizol法提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，以β-actin為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次。采用F=2-△△Ct法分析miR-214-5p相對表達量。β-actin引物：上游：5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游：5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。

1.4Western印跡 各組細胞中加入RIPA裂解液，置于冰上裂解細胞，4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清。將蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入兔抗HOXA13(1∶500)、ICAM-1(1∶2 000)、BMP7(1∶500)、FN(1∶500)和β-actin(1∶1 000)抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌；ECL發光顯影，每個蛋白樣品重復3次。

1.5雙熒光素酶報告基因實驗 取HMC細胞，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書分別將HOXA13 3′UTR野生型質粒或突變型質粒分別與control mimics、miR-214-5p mimics、control inhibitors和miR-214-5p inhibitors共轉染，培養48 h后加入裂解液裂解。4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，檢測熒光素酶活性。

1.6統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1高糖誘導HMC細胞中miR-214-5p表達上調 HG組細胞中miR-214-5p表達水平顯著高于NG組(4.67±0.35 vs 1.01±0.10;t=30.164,P<0.001)。

2.2HMC細胞轉染miR-214-5p inhibitors的效率檢驗 Control組miR-214-5p相對表達水平為1.00±0.14；anti-miR-214-5p組細胞中miR-214-5p相對表達水平顯著低于anti-miR-con組(0.33±0.08 vs 0.96±0.13;P<0.001)。

2.3下調miR-214-5p表達抑制高糖誘導的HMC細胞炎癥反應及纖維化 對比NG組，高糖刺激的HMC細胞中ICAM-1和FN蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，BMP7蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；而將miR-214-5p inhibitors轉染至HMC細胞進行預處理后，高糖刺激的細胞中ICAM-1和FN蛋白表達水平較HG+anti-miR-con組顯著降低(P<0.05)，而BMP7蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖1、表1。

1～4：NG組、HG組、HG+anti-miR-con組、HG+anti-miR-214組圖1 Western印跡檢測ICAM-1、BMP7、FN蛋白表達

表1 下調miR-214-5p表達抑制高糖誘導的HMC細胞炎癥反應及纖維化

2.4miR-214-5p靶向調控HOXA13表達 通過Targetscan在線預測發現，HOXA13 3′UTR上存在miR-214-5p的結合位點(圖2)；miR-214-5p mimics與HOXA13 3′UTR-WT共轉染后熒光素酶活性下降(0.35±0.06 vs 1.00±0.11;t=15.563,P<0.001)，而與HOXA13 3′UTR-MUT共轉染后熒光素酶活性無明顯變化(0.99±0.11、0.98±0.07；t=0.230,P=0.821)；并且過表達miR-214-5p，HOXA13蛋白表達水平顯著降低(0.30±0.06 vs 1.00±0.10，P<0.05)，抑制miR-214-5p表達則HOXA13蛋白表達水平顯著升高(1.86±0.14 vs 0.98±0.08,P<0.05)。見圖3。

圖2 miR-214-5p靶向調控HOXA13的表達

1～4：miR-con組、miR-214組、anti-miR-con組、anti-miR-214組圖3 Western印跡檢測HOXA13蛋白表達

2.5過表達HOXA13抑制高糖誘導的HMC細胞炎癥反應及纖維化 與NG組比較，高糖刺激的HMC細胞中ICAM-1和FN蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，BMP7蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；而將pcDNA-HOXA13轉染至HMC細胞后，高糖刺激的細胞中ICAM-1和FN蛋白表達水平較HG+pcDNA組顯著降低(P<0.05)，而BMP7蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖4和表2。

1～4:NG組、HG組、HG+pcDNA組、HG+pcDNA+HOXA13組圖4 Western印跡檢測HOXA13、ICAM-1、BMP-7、FN蛋白表達比較

2.6miR-214-5p和HOXA13對高糖干預的HMC細胞TGF-β1信號通路的影響 HG組TGF-β1蛋白表達水平顯著高于NG組(3.10±0.30 vs 1.00±0.11,P<0.05)；HG+anti-miR-214組TGF-β1蛋白表達水平較HG+anti-miR-con組顯著降低(1.30±0.10 vs 3.17±0.28,P<0.05)；HG+anti-miR-214+si-HOXA13組TGF-β1蛋白表達水平較HG+anti-miR-214+si-con組顯著升高(2.70±0.12 vs 1.40±0.13,P<0.05)。見圖5。

1～6:NG組、HG組、anti-miR-con組、anti-miR-214組、anti-miR-214+si-con組、anti-miR-214+si-HOXA13組圖5 Western印跡檢測TGF-β1蛋白表達

3 討 論

TGF-β1在DN發生發展中起關鍵作用，可與跨膜受體結合而激活Ⅰ型受體，活化的Ⅰ型受體進一步催化下游信號分子Smads磷酸化，從而誘導下游級聯反應〔8〕。TGF-β1可刺激成纖維細胞分泌FN、層黏蛋白等細胞外基質蛋白，同時促進單核細胞、巨噬細胞等炎癥細胞的浸潤，誘導上皮間質轉化(EMT)〔9〕。BMP-7屬于TGF-β超家族，是一種分泌型多功能蛋白，可上調鈣黏附蛋白E表達，逆轉TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞分化，同時抑制上皮細胞凋亡并減少炎性細胞因子釋放，從而拮抗TGF-β1的促纖維化作用〔10〕。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，能夠通過與其受體特異性結合增強炎癥細胞與內皮細胞間的黏附作用，可促進炎癥反應；抑制FN、TGF-β1和ICAM-1蛋白表達可減緩腎纖維化〔11〕。

miRNA在細胞生長代謝過程中起重要作用，其異常表達與多種疾病的發生發展密切相關。據報道〔12,13〕，miRNA能夠調控胰島素分泌，通過調控血管緊張素(Ang)Ⅱ、TGF等抑制腎間質纖維化，緩解腎小球損傷，并抑制炎癥反應和足細胞凋亡。研究〔14〕表明，miR-214可通過調節基質金屬蛋白酶(MMP)、Ⅰ型膠原表達，抑制AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞纖維化；過表達miR-214能夠增強肝細胞增殖、遷移和侵襲能力，促進肝纖維化形成〔15〕。此外，已有相關研究〔16〕證實，miR-214-5p在肝細胞中異常表達，過表達miR-214-5p可上調MMP-2、α-平滑肌肌動蛋白和TGF-β1等纖維化相關基因表達，促進肝纖維化。本研究以30 mmol/L D-葡萄糖刺激HMC細胞，細胞中miR-214-5p表達上調，ICAM-1和FN蛋白表達水平升高而SMP-7蛋白表達水平降低；抑制miR-214-5p表達則細胞中ICAM-1、FN和SMP-7蛋白表達水平的升高或降低均有所恢復。提示，miR-214-5p對高糖誘導的HMC細胞纖維化具有抑制作用。通過Targetscan在線預測、雙熒光素酶報告基因實驗及Western印跡驗證發現，miR-214-5p可靶向調節HOXA13蛋白表達。

同源盒基因(HOX)基因最早在果蠅被中發現，能夠調控組織器官發育并維持其正常生物學功能，在胃腸道、中樞神經系統等組織器官發育中起關鍵調節作用〔17〕。HOXA13在胃癌、膠質瘤等病灶組織中異常表達，其表達水平與病情分級和預后密切相關，能夠通過調節磷酸化Smad蛋白表達及TGF-β信號傳導途徑促進細胞侵襲及EMT〔18,19〕。而在高糖誘導的HK-2人腎小管上皮細胞中，HOXA13和BMP-7蛋白表達水平顯著降低，通過上調HOXA13表達可抑制高糖誘導的HK-2細胞EMT的發生〔20〕。此外，彭力等〔21〕采用脂質體轉染技術在人腎小管上皮細胞中上調HOXA13表達發現，BMP-7表達上調，高糖誘導的EMT受到抑制。本文將pcDNA-HOXA13轉染至HMC細胞后，ICAM-1和FN蛋白表達顯著受到抑制；SMP-7蛋白表達水平升高，這一結果與文獻〔21〕一致。而采用RNAi技術沉默HOXA13表達可逆轉下調miR-214-5p對TGF-β1蛋白表達的抑制作用。

綜上所述，高糖可刺激HMC細胞中miR-214-5p高表達，通過抑制miR-214-5p可靶向負調控HOXA13表達，從而激活TGF-β1通路，發揮抗炎和抗纖維化作用；提示，miR-214-5p可能成為糖尿病腎病的生物標志物，并且miR-214-5p和HOXA13有望成為DN治療的新靶點。