lncRNA-UCA1通過調節TGFβ1對海人酸誘導小鼠癲癇的保護作用

楊誠 羅濤 彭夏培 肖敏 傅曼

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院神經內科，湖北 武漢 430014)

癲癇患者常表現為反復、突然抽搐、感覺、意識或精神等異常。長期、頻繁或嚴重的癲癇發作會導致進一步的腦損傷甚至持久性的神經精神障礙〔1〕。癲癇持續狀態(SE)可導致急性和持久的中樞神經系統損傷及海馬神經元損傷。SE的急性期后，缺血、缺氧、水腫和炎癥反應會發生在海馬區，包括誘導興奮性氨基酸的釋放，大量鈉離子和鈣離子等相關機制的變化，導致神經元損傷(包括海馬神經元丟失，神經細胞凋亡、膠質細胞增殖、苔蘚纖維發芽、海馬硬化等)，這就是慢性自發性癲癇發生和發展的主要原因。最后就逐漸形成難治性的顳葉癲癇〔2〕。顳葉癲癇發病率占所有癲癇的25%，臨床上針對該種癲癇類型病人的多種抗癲癇藥物的療效并不理想〔3〕。轉化生長因子(TGF)β1的激活可以通過膠質細胞有效率地引起廣泛的基因表達和調節細胞因子的目標基因的轉錄，在炎癥和免疫反應中發揮作用來保護神經元的損傷〔4〕。雖然很少有文獻報道癲癇發作伴隨著TGFβ1在大腦中的表達減少，從而導致神經元死亡和激活的膠質細胞，并促進癲癇小鼠的腦部病變，但有相關報道〔5〕講述了癲癇中與TGFβ1相關的調節機制。長鏈非編碼RNA(lncRNA)通常分為基因間lncRNA、基因內RNA、競爭內源性RNA，高度保守的轉錄區域和反義RNA等〔6〕。與可以編碼蛋白質的RNA相比，lncRNA具有更短的長度、更少的外顯子、更弱的編碼能力及組織細胞特異性；與mRNA相比，lncRNA在相近的物種中具有更低的保守性〔7〕。研究〔8〕發現，lncRNA的表達有組織特異性，與大腦發育、神經元分化和神經系統疾病等密切相關，例如神經退行性疾病、腦缺血、膠質瘤與癲癇。尿道上皮癌相關(UCA)1是一個lncRNA，已知在膀胱癌中表達上調。UCA1被認為在胚胎發育與腫瘤侵入及增殖中起到調控作用，它參與調控腫瘤發生和胚胎發育中的好幾個基因〔9〕。已有研究〔10〕發現，在海馬移除手術的顳葉癲癇病人中UCA1展現出異常的甲基化，但是它導致癲癇發作的可能機制沒有進一步研究。本研究旨在探討lncRNA-UCA1通過調節TGFβ1對海人酸誘導小鼠癲癇的保護作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物癲癇造模及評級標準 實驗材料：C57/B6健康小鼠90只，鼠齡4～6個月，體重160～280 g，由武漢中心醫院提供。隨機分為對照組30只和實驗組60只。動物飼養：C57/B6小鼠(10～12 w)飼養于(23±2)℃，12 h白光/12 h黑暗交替的IVC動物房，自由飲食/進水。

模型制備：實驗組腹腔注射海人酸20 mg/kg后即連續觀察5 h小鼠行為變化。當小鼠持續癲癇性發作達1 h給予地西泮4 mg/kg腹腔注射，如不能緩解癲癇性發作，可重復給予地西泮一兩次，直到癲癇性發作被解除。對照組以35 μl/g生理鹽水取代海人酸，其余用藥、步驟及方法與實驗組相同。分別在建模成功后第1、7、14、30、60天處死小鼠，然后根據實驗情況隨機選擇小鼠進行實驗。

1.2免疫熒光染色 小鼠灌流取腦組織蔗糖梯度脫水后利用冰凍切片切冠30 μm，先用1×磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗腦片，5 min一次洗3次；利用0.5%Triton in PBS破膜，室溫孵育30 min；利用3%胎牛血清封閉，室溫封閉1 h；孵育c-Fos一抗(ab190289，1∶200，abcam)，4℃過夜孵育12 h；利用1×PBS清洗腦片，5 min一次洗3次；孵育熒光二抗(A10040，1∶200，invitrogen)，室溫孵育1 h，最后孵育4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)(1∶500)5 min，清洗貼片。

1.3qRT-PCR 采用Trizol(Invitrogen)法提取總RNA，并使用分光光度計測濃度和純度,使用FSQ-301 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remove試劑盒進行逆轉錄，用于UCA1和TGFβ1的檢測。按說明使用SYBRs GREEN PCR Master Mix(Applied Biosystems)配置預混液，在ABI7500 qRT-PCR系統(Applied Biosystems)R擴增，采用ΔΔCT 法分析。以GAPDH為UCA1和TGFβ1的內參。

UCA1正向引物：5′-ACCTCA ACCCAAAGGCAG-3′；反向引物：5′-GCCTTTGTGCCGCTACTTTT-3′；TGFβ1 正向引物：5′-CCTCGTCATCTGTCTCGCAT-3′；TGFβ1 引向引物：5′-AGTCGTCCGTCTGTAGTGAT-3′；GAPDH正向引物：5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′；反向引物:5′-TGTATCCAAAC TCATTGTCATAC-3′。

1.4立體定位注射 麻醉：5%水合氯醛，腹腔緩慢注射，210 mg/kg，隨時注意動物狀態。頭部固定：將小鼠的門齒固定于腦定位儀上頜固定器，然后把一側的耳捧推入動物的外耳道后，使動物的頭在處于兩滑道正中。再將另一耳捧推入另一側的外耳道。這時觀察兩個耳棒的刻度一致后，將兩耳棒上的固定螺絲扭緊，在將牙齒固定器上壓鼻環壓下后扭緊，這時從各個方向推壓動物頭部均不會出現移動。開顱鉆孔前的備皮：剪去動物頭部毛，用2% 碘酒及75% 酒精棉球作頭部皮膚的消毒，沿矢狀縫做一約0.8 cm長的皮膚切口，分離皮下組織，用雙氧水清潔顱骨表面的筋膜及肌肉并剝離，推開骨膜，暴露前囟、人字縫及矢狀縫。確定標準中線：將金屬定位針向下移動到矢狀縫上方后，再前后移動定位針，確保矢狀縫在一條直線上；使定位針定位到前囟，然后移動到后囟，保證前后囟的高度一致。海馬DG定位：用定位針在前囟后2.1 mm,矢狀縫旁開1.3 mm處定位一點，即為海馬的平面位置，然后在此點上用鉆孔針在顱骨上鉆一小圓孔。小鼠海馬DG則位于該圓孔下2 mm。注射病毒(LV-U6-shUCA1，Genechem)：將微量注射器吸入病毒后，安置到微量注射泵上，使注射器針頭由小鼠腦鉆孔處下降2 mm時，開始病毒注射。注射速度：50 nl/min。注射劑量：2 μl/DG。留針：注射完成后，原位置留針5 min，然后上移1 mm，繼續留針5 min，拔針。縫皮：2% 碘酒及75% 酒精棉球作頭部皮膚的消毒后，縫皮。

1.5統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行方差分析、t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1小鼠癲癇發作分級 癲癇性發作按Racine分級標準進行判定：0級，無抽搐發作；Ⅰ級，耳、面部抽搐；Ⅱ級，肌陣攣，但無直立位；Ⅲ級，肌陣攣，伴直立位；Ⅳ級，全身強直陣攣發作；Ⅴ級，強直陣攣發作，并失去體位控制。以出現持續1 h的Ⅲ級以上的發作，并在解除癇性發作后狀態良好的小鼠為癲癇持續狀態模型成功鼠。實驗組均為癇性發作，經處理后呈持續性Ⅲ～Ⅳ級發作，其中56只經地西泮處理后緩解，為癲癇持續狀態模型成功鼠，成功率為93.33%(56/60)。實驗組海馬區c-Fos染色表明海人酸腹腔注射誘導癲癇模型中及早基因c-Fos主要表達在小鼠大腦海馬的DG區(圖1、2)。

2.2UCA1與TGFβ1在癲癇不同時間點均表達上調 癲癇造模后取不同時間點(1、7、14、30、60 d)小鼠海馬組織提RNA進行qRT-PCR檢測UCA1與TGFβ1的表達情況。將對照組表達量全部均化為1之后，實驗組1 d UCA1相對表達水平(4.831 3±0.072 1)，7 d(6.751 8±0.114 3)，14 d(12.642 5±1.007 8)，30 d(4.765 9±0.069 6)，60 d(2.433 1±0.070 2)均明顯上升(P<0.01);實驗組1 d TGFβ1相對表達水平(0.682 5±0.010 8)，7 d(0.753 8±0.080 3)，14 d( 0.344 2±0.015 7)，30 d(0.160 9±0.008 6)，60 d(0.357 1±0.009 3)均明顯下降(n=3，均P<0.01)。

圖1 癲癇造模后c-Fos免疫熒光染色(×2)

圖2 實驗組小鼠腦組織海馬區放大c-Fos熒光染色結果(×2)

2.3沉默UCA1的表達下調TGFβ1并緩解癲癇發作等級 進一步設計UCA1的shRNA并包裝成慢病毒注射到小鼠海馬DG區，3 w后取小鼠海馬組織提取RNA做qRT-PCR檢測TGFβ1的表達發現，病毒注射實驗組TGFβ1的表達(2.275 9±0.231 2，P<0.01)較對照組(0.987 3±0.004 5)顯著升高(n=4，P<0.01)。將病毒注射組3 w后與正常老鼠同時進行海人酸癲癇造模，結果顯示實驗組成功率〔43.33%(13/30)〕較對照組〔83.33%(25/30)〕顯著降低(n=30，均P<0.01)。

3 討 論

TGFβ1通過細胞表面的受體信號轉導途徑調控者細胞的增殖、分化、黏附、轉移和凋亡。它參與了多種不同疾病的發生與發展，在神經系統中與許多生理病理過程相關，并發揮著神經保護作用。TGFβ1廣泛存在于靜息狀態細胞的細胞質中。當細胞受到環境的刺激時，特異的抑制性蛋白抑制劑IkB可以被磷酸化和滅活，所以TGFβ1被激活入核；然后TGFβ1 結合到細胞核內的一些增強子基因的元件GGGRNNYYCC，開始啟動或調節早期反應基因的轉錄及參與炎癥反應、細胞增殖和細胞凋亡〔11〕。癲癇是一種常見的中樞神經系統疾病，TGFβ1可能通過作用于神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞等及經由多種信號轉導途徑影響癲癇的形成和發展。之前有研究〔12〕癲癇發作后海馬的炎癥與免疫反應時發現，長時間的癲癇發作導致TGFβ1失活的標志就是TGFβ1的表達減少，癲癇發作引起的炎癥級聯反應可能會導致TGFβ1在星形膠質中過表達。鑒于TGFβ1激活癲癇的發病機制的復雜性，其信號轉導系統已經成為當前的研究熱點之一。大量研究〔13，14〕顯示，lncRNA在大腦中豐富表達，參與調控大腦發育，在神經系統中發揮重要作用。近年發現〔15〕成年小鼠腦中有849個lncRNA參與神經系統的發育，lncRNA同樣可以參與癲癇的發生發展。本研究結果表明，UCA1和TGFβ1的表達水平隨時間的變化是成負相關的，由此可以推斷UCA1和TGFβ1之間存在著調控作用。本實驗結果表明UCA1在海人酸誘導小鼠癲癇中通過與TGFβ1的相互作用來誘發或者加劇癲癇癥狀，通過抑制UCA1的表達可以上調TGFβ1進而抑制緩解癲癇發作。