上調(diào)VEGF-B基因?qū)β孕牧λソ叽笫蟮淖饔眉皺C(jī)制

陳磊 吳小燕 (海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，海南 海口 570100)

慢性心力衰竭屬于心功能逐漸減退的病理過(guò)程，當(dāng)心力衰竭出現(xiàn)后，心臟會(huì)在疾病的作用下導(dǎo)致引起心肌重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致心功能出現(xiàn)進(jìn)行性的下降〔1〕。有研究表明〔2〕，慢性心力衰竭的基本病理機(jī)制為心肌重構(gòu)，當(dāng)心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生改變后，心肌舒張功能出現(xiàn)障礙，心排血量明顯不足，不能滿足機(jī)體所需要的代謝需求，其臨床表現(xiàn)為日常活動(dòng)受限，伴隨著不同程度的呼吸困難，屬于多種心血管疾病的終末階段。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-B屬于VEGF家族中的成員，具有促血管生成、保護(hù)神經(jīng)、供給機(jī)體營(yíng)養(yǎng)的作用，并參與脂質(zhì)代謝等生物學(xué)過(guò)程〔3〕。VEGF-B作為一種促進(jìn)血管生成因子，具有促進(jìn)心肌血管新生和促進(jìn)心肌血管內(nèi)皮的增殖的作用〔4〕。有研究表明〔5〕，低水平的VEGF-B和心臟疾病中發(fā)生心室重構(gòu)、左心室功能有關(guān)。本研究觀察上調(diào)VEGF-B基因?qū)β孕牧λソ叽笫笞饔眉皺C(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 研究動(dòng)物：選取SPF級(jí)SD健康大鼠40只，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，鼠齡(3.9±0.6)個(gè)月，體重(225.8±11.5)g。所有大鼠養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫(22.1±1.8)℃，相對(duì)濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時(shí)間1 w。本研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

主要試劑：Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(購(gòu)于北京義翹神州科技有限公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(購(gòu)于武漢純度生物科技有限公司)，Ca試劑盒、CaN試劑盒(購(gòu)于南京建成生物工程研究所)，小鼠抗大鼠NFAT3抗體、兔抗大鼠p-NFAT3抗體(購(gòu)于Santa cruz公司)。

1.2方法

1.2.1基因轉(zhuǎn)染 取小鼠心肌細(xì)胞放置于RPMI 1640培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清)、恒溫為37℃、含有體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%時(shí)使用0.25%的胰酶消化，傳代。按照Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明書(shū)對(duì)小鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染物的不同將小鼠心肌細(xì)胞分為siRNA-VEGF-B(上調(diào))細(xì)胞、siRNA-對(duì)照序列細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的小鼠心肌細(xì)胞放置于恒溫為37℃、含有體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2建模及分組 隨機(jī)選取40只小鼠中的10只作為對(duì)照組，另外30只小鼠建立參照Ahemed等〔6〕研究實(shí)驗(yàn)中腹腔注射阿霉素的方法建立慢性心力衰竭大鼠模型，將阿霉素配制成2 mg/ml的溶液連續(xù)6 w注射于大鼠腹腔(4 mg/kg)，使用10%水合氯醛注射于大鼠腹腔進(jìn)行麻醉處理，之后使得大鼠仰臥在操作臺(tái)上，并作固定，剃除大鼠胸前區(qū)毛發(fā)，測(cè)定心臟左心射血分?jǐn)?shù)，當(dāng)左心射血分?jǐn)?shù)<60%時(shí)則表示慢性心力衰竭大鼠模型建立成功。將建模成功的30只慢性心力衰竭大鼠隨機(jī)分為模型組、上調(diào)組、下調(diào)組各10只。將轉(zhuǎn)染后的小鼠siRNA-VEGF-B(上調(diào))心肌細(xì)胞、siRNA-對(duì)照序列(下調(diào))心肌細(xì)胞分別注射于上調(diào)組、下調(diào)組小鼠心肌處，模型組和對(duì)照組不做任何處理。

1.2.3樣本采集 隨機(jī)選取各組中的7只大鼠采用斷頭法處死，立即取大鼠心肌組織，將提取的組織制作標(biāo)本，使用40 ml/L的多聚甲醛進(jìn)行固定，常溫下使用15%的乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，其中各組中的1份心肌組織樣本行病理組織學(xué)觀察，其中3份心肌組織剪碎放置于器皿中，之后將5 ml 25%的膠原酶Ⅱ加入，將心肌細(xì)胞分離出，剩余3份心肌組織樣本行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.4病理組織學(xué)觀察 取各組中的1份心肌組織樣本行病理組織學(xué)觀察，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色處理后使用顯微鏡觀察病理變化。

1.2.5心功能測(cè)定 對(duì)各組剩余的3只大鼠心功能進(jìn)行檢測(cè)，在檢測(cè)前稱(chēng)量各大鼠體質(zhì)量，并10%水合氯醛腹腔注射于大鼠腹腔進(jìn)行麻醉處理(0.004 ml/kg)，仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。做氣管插管，行氣管插管并連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，將右頸外動(dòng)脈分離后行結(jié)扎處理，結(jié)扎所分離出的右頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，使用動(dòng)脈夾對(duì)大鼠動(dòng)脈近心端夾閉，并在動(dòng)脈壁剪以小口，將帶有肝素的靜脈穿刺套管針逆行刺入，并慢慢將穿刺針退出，緩慢將導(dǎo)管推進(jìn)左心室，之后將穿刺套管核和壓力換能器相連接，將BL-420S生物信號(hào)采集和分析系統(tǒng)接入，記錄四組大鼠左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓力上升的最大速率(+dp/dt)、左心室內(nèi)壓力下降的最大速率(-dp/dt)及心率變化。

1.2.6心室重構(gòu)參數(shù)測(cè)定 在大鼠完成上述心功能測(cè)定后將3 ml 10%氯化鉀液注射于靜脈中，促使大鼠心臟在舒張末期停止搏動(dòng)，之后迅速打開(kāi)大鼠胸腔，將心臟取出，使用冷勝利鹽水沖洗，之后將心臟外結(jié)締組織、大血管及心房取出，將右心室沿著室間隔剪去，使用濾紙吸干后對(duì)左心室質(zhì)量(LVAM)進(jìn)行稱(chēng)取，計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)，LVMI=LVMI/大鼠體重，使用直接測(cè)量法計(jì)算大鼠左心室短軸、長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，計(jì)算球形指數(shù)(SI)，SI=左心室長(zhǎng)軸長(zhǎng)度/左心室短軸長(zhǎng)度。

1.2.7心肌細(xì)胞中Ca2+濃度檢測(cè) 將所分離出的心肌細(xì)胞放置于溫度為37℃水中行水浴處理，之后使用Fluo/AM避光孵育，孵育時(shí)間為1 h，之后在轉(zhuǎn)速為3 000 r/min的離心機(jī)中離心處理1 min，去除負(fù)載液，并使用生理記錄液反復(fù)洗滌3次。使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)形態(tài)完成、染色效果較好的細(xì)胞進(jìn)行掃描，心肌細(xì)胞中熒光值(鈣離子濃度)測(cè)定：激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm。之后使用計(jì)算機(jī)將圖像處理，得到細(xì)胞內(nèi)分布圖。最后經(jīng)過(guò)系統(tǒng)分析、換算出心肌細(xì)胞中Ca2+濃度。

1.2.8心肌組織中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)活性、T細(xì)胞活化因子(NFAT)3、磷酸化(p)-NFAT3蛋白檢測(cè) 使用酶學(xué)比色法檢測(cè)四組大鼠心肌組織中CaN活性，使用Western印跡檢測(cè)四組大鼠心肌組織中NFAT3、p-NFAT3蛋白表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組病理組織學(xué)觀察 如圖1所示，對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、橫縱紋較為清晰，細(xì)胞核形態(tài)、大小正常，心肌細(xì)胞間質(zhì)無(wú)纖維細(xì)胞增生。模型組大鼠心肌細(xì)胞排列混亂，間隙腫脹、增寬，心肌纖維缺損，細(xì)胞核呈現(xiàn)為圓形，細(xì)胞質(zhì)不均勻。下調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞排列混亂呈現(xiàn)為波浪狀，無(wú)橫縱紋，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞質(zhì)不均勻，心肌細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，心肌纖維缺損、斷裂。上調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，可見(jiàn)有橫縱紋，存在輕度的心肌纖維顆粒狀變性，且存在缺損、斷裂，細(xì)胞核呈現(xiàn)為圓形。

圖1 各組大鼠病理組織學(xué)觀察(HE，×100)

2.2各組大鼠心功能指標(biāo)變化比較 與對(duì)照組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明顯降低，LVEDP、心率均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明顯降低，LVEDP、心率均升高，上調(diào)組大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明顯升高，LVEDP、心率均明顯降低(均P<0.05)；與下調(diào)組大鼠相比，上調(diào)組大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明顯升高，LVEDP、心率均明顯降低(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組大鼠心室重構(gòu)情況比較 與對(duì)照組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠LVAM、LVMI均明顯增大，SI均明顯縮小(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組大鼠LVAM、LVMI明顯增大，SI明顯縮小，下調(diào)組大鼠LVAM、LVMI明顯增大，SI明顯縮小(均P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組大鼠LVAM、LVMI明顯縮小，SI明顯增大(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4各組大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+濃度、心肌組織中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白變化比較 與對(duì)照組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+濃度、心肌組織中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表達(dá)量均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+濃度、心肌組織中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表達(dá)量均明顯升高，上調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+濃度、心肌組織中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表達(dá)量均明顯降低(均P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+濃度、心肌組織中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表達(dá)量均明顯降低(均P<0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

表2 各組大鼠心室重構(gòu)情況比較

組別Ca2+濃度(nmol/L)CaN(U/mg蛋白)NFAT3p-NFAT3對(duì)照組79.56±5.455.62±0.340.25±0.090.18±0.01模型組149.56±15.261)12.45±2.251)0.89±0.121)0.65±0.051)下調(diào)組169.56±20.141)2)15.24±3.121)2)0.96±0.101)2)0.73±0.101)2)上調(diào)組100.24±7.621)2)3)7.23±0.981)2)3)0.69±0.011)2)3)0.45±0.091)2)3)F/P值5.735/0.0014.032/0.00112.624/0.0017.747/0.001

圖2 Western印跡檢測(cè)心肌組織中NFAT3、p-NFAT3蛋白

3 討 論

慢性心力衰竭的發(fā)生可導(dǎo)致心功能、心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，且多數(shù)患者均伴隨著神經(jīng)體液變化和血流動(dòng)力學(xué)的改變，最終導(dǎo)致動(dòng)脈血液灌注不足、靜脈淤血等〔7〕。目前隨著我國(guó)老齡化現(xiàn)象的日益加重，多種心血管疾病的發(fā)病率逐漸升高，慢性心力衰竭的發(fā)病率隨之升高，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命安全，因此防治慢性心力衰竭對(duì)降低疾病發(fā)病率和死亡率尤為重要〔8〕。

VEGF-B在臨床上一直被認(rèn)為是血管內(nèi)皮因子家族中的具有多種生物學(xué)功能的多條，能對(duì)血管外基質(zhì)講解、細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附等具有調(diào)節(jié)作用，對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、內(nèi)皮細(xì)胞分化成管腔具有調(diào)節(jié)作用，為血管的再生提供了有利條件〔9，10〕。微血管灌注重要組成部分為心肌血管再生，可促進(jìn)心臟修復(fù)和改善心室重構(gòu)〔11〕。VEGF-B能夠促進(jìn)心肌血管內(nèi)皮增殖，對(duì)血管再生具有調(diào)節(jié)作用，可對(duì)受損的心肌細(xì)胞具有修復(fù)作用〔12〕。目前有研究表明，在患有心臟疾病的患者中，其血清中VEGF-B水平顯著低于健康人〔13〕。本研究結(jié)果提示，上調(diào)VEGF-B基因可在一定程度上改善慢性心力衰竭大鼠心功能和心室重構(gòu)，促進(jìn)大鼠心臟功能的恢復(fù)。

慢性心力衰竭的發(fā)生與心肌重構(gòu)的發(fā)生有關(guān)，有研究表明〔14～16〕，Ca2+-CaN-NFAT3信號(hào)通路參與多種原因所導(dǎo)致的心肌重構(gòu)、心力衰竭、心肌肥大等發(fā)展過(guò)程，并在上述病理過(guò)程中有著重要的意義。心肌重構(gòu)是慢性心力衰竭發(fā)生的病理基礎(chǔ)，在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中CaN作為起始信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，活化T細(xì)胞核因子屬于CaN作用的下游靶點(diǎn)，而NFAT3屬于CaN下游靶點(diǎn)所調(diào)控的蛋白，在CaN所介導(dǎo)的心肌重構(gòu)中具有重要的作用〔17～19〕。Ca2+屬于一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)信使，進(jìn)而CaN所介導(dǎo)的心肌重構(gòu)信號(hào)通路有關(guān)，當(dāng)心肌細(xì)胞中的Ca2+濃度升高后會(huì)將CaN激活，促進(jìn)p-NFAT3失去磷酸化作用，當(dāng)p-NFAT3去磷酸化后會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)多種和換心肌細(xì)胞相關(guān)基因的異常表達(dá)，最終引發(fā)心肌重構(gòu)的發(fā)生，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生〔20〕。本研究結(jié)果說(shuō)明上調(diào)VEGF-B基因可在一定程度上改善慢性心力衰竭大鼠心功能和心室重構(gòu)，促進(jìn)大鼠心臟功能的恢復(fù)機(jī)制可能與上調(diào)VEGF-B基因后通過(guò)作用于Ca2+-CaN-NFAT3信號(hào)通路，降低心肌細(xì)胞中Ca2+濃度，使得心肌組織中CaN失活，調(diào)控NFAT3、p-NFAT3蛋白表達(dá)有關(guān)。但目前臨床上對(duì)于VEGF-B基因與Ca2+-CaN-NFAT3信號(hào)通路、慢性心力衰竭之間的聯(lián)系并無(wú)研究，因此本研究結(jié)果還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。