RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155的表達及意義

黃 佩，翟 敏，廖廷彥

湖北省棗陽市第一人民醫院兒科，湖北棗陽 441200

呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染的常見病毒，RSV感染可導致免疫損傷，患兒出現咳嗽、氣促、喘憋等癥狀[1-2]。微小RNA(miRNA)可作為免疫系統和免疫反應的調節元件參與人體免疫調節[3-4]。miR-146a在體內充當炎癥調節劑，可影響核轉錄因子-κB(NF-κB)途徑及絲裂原活化蛋白激酶途徑[5]。miR-155在自身免疫和其他慢性炎癥性疾病中發揮作用，影響機體炎性反應[6-7]。miR-146a和miR-155參與調節多種疾病的炎性反應，但二者在RSV下呼吸道感染中的作用報道較少。本研究探討miR-146a、miR-155在RSV下呼吸道感染中的表達及意義，以期為該病的治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年4月至2019年12月本院就診的97例RSV下呼吸道感染患兒作為試驗組，其中男53例，女44例；平均年齡(3.49±1.18)歲。選取同期在本院進行常規體檢的101例健康兒童作為對照組，其中男59例，女42例；平均年齡(3.67±1.26)歲。2組年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。記錄所有受試兒童的身高、體質量等，計算體質量指數(BMI)。納入標準：(1)符合《諸福棠實用兒科學(第8版)》中下呼吸道感染診斷標準者[8]；(2)RSV檢測呈陽性者；(3)就診前2周未使用激素或藥物治療者；(4)5歲以下兒童。排除標準：(1)合并其他慢性疾病者；(2)呼吸道畸形者；(3)先天免疫缺陷者。本研究經本院倫理委員會批準，所有受試兒童家屬均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑盒(批號DXT-15596018)購自上海科敏生物科技有限公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒(批號K1621)購自杭州主諾生物技術有限公司；SYBR Green PCR Master Mix實時熒光定量PCR(qPCR)檢測試劑盒(批號DXT-ST600580)購自密理博(中國)有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6、IL-10及超敏C-反應蛋白(hs-CRP)檢測試劑盒(批號分別為ARB13479、ARF11752、ARB10557、AKF00479)購自北京百奧萊博科技有限公司；qPCR儀(型號100133)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；血細胞分析儀(型號DxH800)購自美國貝克曼庫爾特有限公司；希森美康血球儀(型號XN-2000)購自日本希森美康株式會社。

1.3方法

1.3.1標本采集 抽取2組兒童的空腹外周靜脈血5 mL，加入乙二胺四乙酸抗凝，4 000 r/min離心5 min，吸取上清液于小型離心管中，分裝于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2血清中炎癥因子及相關指標檢測 采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-10及hs-CRP水平；采用血細胞分析儀測定血清中血紅蛋白和清蛋白水平；采用流式細胞術檢測白細胞、紅細胞、中性粒細胞及淋巴細胞數量。

1.3.3qPCR測定血清miR-146a、miR-155水平 從-20 ℃取出標本，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，并檢查純度和完整度；按照反轉錄試劑盒說明書操作，所得cDNA存于-20 ℃冰箱保存。qPCR反應體系(20 μL)：cDNA模板1 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，H2O 8 μL。根據目的基因設計其上下游引物，以U6為內參，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。反應條件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s，35個循環。根據各標本平均循環閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt法計算miR-146a、miR-155水平。

表1 miR-146a、miR-155及內參基因U6引物序列

2 結 果

2.12組一般情況比較 2組BMI、白細胞、紅細胞比較，差異無統計學意義(P>0.05)；試驗組血紅蛋白、清蛋白水平，以及中性粒細胞數量均低于對照組(P<0.05)，淋巴細胞數量高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組一般情況比較

2.22組血清miR-146a、miR-155水平比較 試驗組血清miR-146a、miR-155水平均高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 2組血清miR-146a、miR-155水平比較

2.32組血清炎癥因子水平比較 試驗組血清TNF-α、IL-6、IL-10和hs-CRP水平均高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 2組血清炎癥因子水平比較

2.4RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155水平與炎癥因子的相關性 RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155水平均與TNF-α、IL-6、IL-10和hs-CRP水平均呈正相關(P<0.05)。見表5。

表5 RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155水平與炎癥因子的相關性

2.5影響 RSV下呼吸道感染的多因素分析 將RSV下呼吸道感染是否發生作為因變量，以miR-146a、miR-155、TNF-α、IL-6、IL-10、hs-CRP、血紅蛋白、清蛋白、中性粒細胞和淋巴細胞作為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示高水平的miR-146a、miR-155、TNF-α和IL-10均是影響RSV下呼吸道感染的獨立危險因素(P<0.05)。見表6。

表6 影響RSV下呼吸道感染的多因素分析

3 討 論

RSV感染是世界范圍內5歲以下兒童死亡的主要原因之一，嬰幼兒易受到RSV病毒感染，其中約2/3為上呼吸道感染，1/3為下呼吸道感染[9]。RSV可導致毛細支氣管炎，可能會造成兒童哮喘。RSV感染會導致肺部損傷，并在兒童生長階段長期削弱肺功能，致使持續的氣道高反應[10]。研究表明，在嚴重RSV感染的嬰兒中TNF-α水平較健康嬰兒高[11]。在RSV感染患兒的洗鼻液中發現可溶性細胞間黏附分子-1、IL-10及IL-6水平與疾病嚴重程度相關[12]。RSV下呼吸道感染已被證實與反復性喘息有關，并可能在患兒成年后對其呼吸系統產生一定的影響[13]。本研究檢測RSV下呼吸道感染患兒血清中炎癥因子水平，結果顯示，RSV下呼吸道感染患兒血清TNF-α、IL-6、IL-10和hs-CRP水平均高于健康兒童，與上述結果一致，提示RSV下呼吸道感染可導致炎性反應。臨床上對于RSV下呼吸道感染暫無有效干預措施，缺乏特異性治療，因此探尋RSV下呼吸道感染的治療靶點是當前的研究熱點。

miRNA可參與人體多種生理反應，部分miRNA對炎性反應具有調節作用。miR-146a是miR-146家族成員，位于人5號染色體上，可抑制NF-κB通路活化，抑制炎性反應或維持免疫穩態[14]。miR-146a在幾種自身免疫性疾病的發病過程中起重要作用，如類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、潰瘍性結腸炎和銀屑病等[15]。GUAN等[16]發現，在miR-146a轉染的人軟骨細胞中，IL-6、IL-8和TNF-α水平降低，miR-146a可抑制軟骨細胞中的重要炎癥因子。王盼等[17]研究表明，哮喘兒童血清中miR-146a水平升高，提示miR-146a水平可能與哮喘發病有關。miR-155被認為是促炎因子，可調節細胞因子的產生，從而在先天性免疫反應中發揮作用[18]。miR-155表達受Toll樣受體/NF-κB通路調控，其靶基因多為抗炎因子，miR-155通過抑制其靶基因發揮促炎作用[19]。SINGH等[20]發現，風濕性關節炎患者血清miR-146a、miR-155水平均高于健康人群，并對風濕性關節炎有一定診斷價值。本研究發現，RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155水平均高于健康兒童，提示miR-146a、miR-155可能參與RSV下呼吸道感染的發病進程。通過Pearson相關分析miR-146a、miR-155水平與炎癥因子的相關性，發現RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155水平均與TNF-α、IL-6、IL-10和hs-CRP水平呈正相關，提示二者水平能夠反映出RSV下呼吸道感染患兒的炎癥狀況；Logistic回歸分析發現，高水平的miR-146a、miR-155、TNF-α和IL-10均是影響RSV下呼吸道感染的危險因素，提示降低miR-146a、miR-155水平可能會抑制RSV下呼吸道感染的發生發展。

綜上所述，RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155水平較高，二者均是RSV下呼吸道感染的影響因素。提示miR-146a、miR-155可作為評估RSV下呼吸道感染患兒炎癥狀態的參考指標，有望成為干預或治療RSV下呼吸道感染的潛在靶點。