miR-16聯合Cripto-1、ANXA7診斷胃癌及其淋巴結轉移的臨床價值研究

謝 宇，李會穎，林永娟，孫 巖

1.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院老年醫學科；江蘇南京 210008；2.江蘇省腫瘤醫院內科，江蘇南京 210009

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤，我國是胃癌的高發國家，其每年新發病例數占全球的40%以上[1]。多數胃癌患者在發現時已處于癌癥中晚期，導致患者臨床預后不佳[2]。目前一致認為，早期發現胃癌并采用合理的方案進行干預治療，有助于提高患者生存率，并改善預后[3]。微小核糖核酸(miRNA)是可調控基因轉錄和表達的非編碼RNA，有研究結果證實其在腫瘤的凋亡、增殖、轉移和侵襲過程中扮演十分重要的角色[4]。研究表明，miR-16在胰腺癌、結腸癌、乳腺癌等患者體內水平異常，其可能在惡性腫瘤的診斷和評估中起重要作用[5]。畸胎瘤衍生生長因子(Cripto-1)是可有效維持胚胎干細胞和多能性干細胞的標志物，有學者指出，在多種腫瘤組織中Cripto-1表達處于異常活躍狀態，且在癌變前其水平即會出現明顯升高[6]。膜聯蛋白A7(ANXA7)是近年來被廣泛研究的熱點，具有調節細胞分化、膜轉運、凋亡、鈣離子信號及生長等生物學功能，且在多種腫瘤中均呈現明顯異常表達狀態[7]。目前，miR-16聯合Cripto-1、ANXA7在胃癌早期診斷中的應用報道較少，因而本研究對南京大學醫學院附屬鼓樓醫院收治的胃癌患者進行分析，探討miR-16聯合Cripto-1、ANXA7診斷胃癌及其淋巴結轉移的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2019年9月于南京大學醫學院附屬鼓樓醫院內科治療的胃部疾病患者546例作為研究對象，根據是否符合胃癌診斷標準[1]分為胃癌組(121例)和非胃癌組(425例)。其中胃癌組患者根據胃癌進展情況分為早期胃癌組(44例)和進展期胃癌組(77例)；根據淋巴結是否轉移分為淋巴結轉移組(71例)和無淋巴結轉移組(50例)。非胃癌組中男261例，女164例；平均年齡(67.38±8.32)歲；胃炎206例、胃潰瘍182、其他37例。選擇同期該院體檢健康者50例作為對照組，其中男29例、女21例，平均年齡(68.03±6.31)歲。各組受試者一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。胃癌組納入標準：(1)組織病理學檢查確診為胃癌；(2)入組前未接受化療、放療、免疫療法治療。排除標準：(1)合并嚴重肝、腎系統疾病；(2)合并其他結締組織病；(3)精神異常無法配合本研究。

1.2方法 晨起空腹時抽取靜脈血3 mL置于離心管中，2 500 r/min離心15 min，取上清液500 μL至小型離心管中保存，按照總RNA快速提取試劑盒說明書從中提取總RNA。采用實時熒光定量PCR檢測血清miR-16水平，并以U6作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-16水平，所用引物均購自南京金斯瑞生物科技有限公司。miR-16引物設計如下，上游:5′-ATC AAG CTT ATC AGA CAA GC-3′，下游:5′-ATG TGC CCG GTC AGA GGC-3′。采用酶聯免疫吸附測定檢測血清ANXA7、Cripto-1水平，試劑盒購自南京福麥斯生物科技有限公司。

2 結 果

2.1各組miR-16、ANXA7、Cripto-1水平比較 胃癌組血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平高于對照組和非胃癌組(P<0.05)，見表1。

表1 各組miR-16、ANXA7、Cripto-1水平比較

2.2不同胃癌亞組患者miR-16、ANXA7、Cripto-1水平比較 進展期胃癌組血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平均高于早期胃癌組(P<0.05)，淋巴結轉移組血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平均高于無淋巴結轉移組(P<0.05)，見表2。

表2 不同胃癌亞組患者miR-16、ANXA7、Cripto-1水平比較

2.3miR-16、ANXA7、Cripto-1診斷胃癌的價值 miR-16、ANXA7、Cripto-1診斷胃癌的最佳臨界值分別為11.81、71.51 μg/L、2.26 μg/L，3項指標聯合診斷胃癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.996，其靈敏度(95.04%)和特異度(97.26%)較高，見表3。

表3 miR-16、ANXA7、Cripto-1診斷胃癌的價值

2.4miR-16、ANXA7、Cripto-1診斷胃癌淋巴結轉移的價值 miR-16、ANXA7、Cripto-1診斷胃癌淋巴結轉移的最佳臨界值分別為18.95、78.93 μg/L、3.73 μg/L，3項指標聯合診斷胃癌淋巴結轉移的AUC為0.996，其靈敏度(97.18%)和特異度(96.00%)較高，見表4。

表4 miR-16、ANXA7、Cripto-1診斷胃癌淋巴結轉移的價值

2.5血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平的相關性分析 胃癌患者血清miR-16水平與ANXA7、Cripto-1水平均呈正相關(r=0.465、0.519，均P<0.05)。

3 討 論

胃癌是現階段我國最為常見的消化系統惡性腫瘤，目前呈現明顯的年輕化趨勢，且臨床發病率逐年升高。有研究指出，胃癌早期缺乏特異性的體征和癥狀，導致無法被及時發現，當患者出現臨床表現進行診治時，大多數患者已發展到進展期或發生遠處轉移，錯失了最佳手術時機[8]。因而有學者指出對胃癌進行早期診斷和評估，并及時預測淋巴結轉移對臨床救治具有十分重要的意義[9]。胃癌的發生、發展、轉歸屬于連續性、多階段、多因素的病理過程，發病機制較為復雜，涉及原癌基因及抑癌基因的遺傳學和表觀遺傳學變化，所以選擇合適的生物學指標對胃癌進行判斷，具有一定的理論依據[10]。

有研究表明，miR-16在多種惡性腫瘤患者體內均呈現異常表達狀態，包括miR-16在內的多種miRNA具有評估惡性腫瘤患者轉移、分期和預后的價值[11]。ANXA7在惡性膠質瘤、黑色素瘤、多形性膠質母細胞瘤、前列腺癌、肝癌、結直腸癌等多種腫瘤細胞中均呈現明顯的異常表達狀態，在腫瘤的發生發展過程中起重要作用[12]。Cripto-1是從人類NTERA-2畸胎瘤cDNA中分離和克隆的表皮生長因子家族結構相關蛋白，在胚胎發育過程中起不可或缺的作用[13]，有效參與并調控腫瘤細胞上皮間質轉化，促進腫瘤細胞轉移和浸潤[14]。本研究表明胃癌組患者血清ANXA7、miR-16、Cripto-1水平高于對照組及非胃癌組，有相關研究顯示，在胃癌細胞中ANXA7蛋白定位于細胞質和細胞核，呈線網狀或黃色顆粒分布，且其在胃癌細胞中的水平明顯高于正常細胞[12-14]。進展期胃癌組血清miR-16、ANXA7、Cripto-1水平高于早期胃癌組。進一步分析顯示，miR-16、ANXA7、Cripto-1這3項指標聯合診斷胃癌的AUC為0.996，有較高的靈敏度和特異度，3項指標聯合診斷胃癌淋巴結轉移的AUC為0.996，也有較高的靈敏度和特異度。Pearson相關分析結果顯示，胃癌患者血清miR-16水平與ANXA7、Cripto-1水平均呈正相關。此前，有相關報道也顯示在胃癌組織中多種miRNA呈現明顯的異常表達狀態，且相關miRNA水平隨淋巴結的轉移而升高，因而推測miRNA可作為影響胃癌患者病情進展的獨立危險因素[15]。Cripto-1可與膜相關磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1特異性結合，激活酪氨酸激酶，并活化Akt信號通路，具有促進細胞遷移、增殖和浸潤的作用。此外，生長因子β配體還可與Cripto-1形成復合物，抑制轉化生長因子-β信號傳導，加速腫瘤細胞增殖。分析認為miR-16、ANXA7、Cripto-1相互影響，且可能隨著患者病情進入進展期和淋巴結的轉移，患者的腫瘤負荷增大，導致腫瘤組織釋放大量與原癌基因作用的miRNA和蛋白質進入血液，引起各指標水平明顯升高。3項指標聯合應用可有效診斷胃癌及其淋巴結轉移，可從多角度對患者體內腫瘤細胞的變化狀態進行有效評估，所評估的結果相對更為精準。

綜上所述，血清miR-16、Cripto-1、ANXA7在胃癌患者中水平升高，且進展期患者和淋巴結轉移患者的上述指標水平明顯高于早期胃癌患者和無淋巴結轉移患者，表明隨著病情加重，血清miR-16、Cripto-1、ANXA7水平升高，miR-16水平與Cripto-1、ANXA7水平呈正相關，3項指標聯合應用可有效診斷胃癌及其淋巴結轉移，具有較高的臨床價值。