MALDI-TOF MS檢測人乳頭瘤病毒18種基因型的性能評價研究

王萌萌，熊 丹，湯花梅，張水蘭，闞麗娟，豆小文，李 悅，宗曾艷，張秀明△

1.廣東省深圳市羅湖區人民醫院醫學檢驗科，廣東深圳 518001；2.安徽理工大學醫學院，安徽淮南 232001

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)核酸檢測系統是一種將PCR與MALDI-TOF MS檢測系統相結合用于高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)分型診斷的新方法。該法由多重PCR反應、單堿基延伸和飛行時間質譜分析三步構成，可準確快速地實現多基因多位點檢測[1]。本研究依據《人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測及基因分型、試劑技術審查指導原則》[2]、醫學實驗室檢測系統性能評價的相關要求和參考文件，對MALDI-TOF MS 檢測系統檢測18種HR-HPV核酸的準確度、檢測下限和抗交叉反應能力進行評價，并將其檢測結果與Cobas4800和之江HR-HPV 2種實時熒光定量PCR(qPCR)檢測系統進行一致性評價，以期為病原體核酸質譜檢測性能驗證提供重要參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年9-11月在深圳市羅湖區人民醫院進行宮頸癌篩查的患者的宮頸脫落細胞標本，初篩選取347份宮頸脫落細胞標本，其中羅氏保存液收集標本180份，之江保存液收集標本167份，標本保存在-80 ℃冰箱。納入標準：(1)剩余標本量>2 mL的標本；(2)收集的陽性標本需涵蓋HPV16、18型及其他12種羅氏檢測型別。排除標準：影響檢測結果的標本，如紅細胞水平過高的標本。

1.2儀器與試劑 Cobas x480全自動核酸提取儀、Cobas z480 qPCR儀及其配套試劑盒均購自美國羅氏公司；Autrax全自動核酸提取工作站及其配套試劑盒購自上海之江公司；Smart32半自動核酸提取儀、Applied Biosystems Veriti 384 qPCR擴增儀、Heraeus fresco 21離心機均購自美國Thermo Fisher Scientific公司； DR MassArray MALDI-TOF MS檢測系統及HPV分型核酸檢測試劑盒購自廣州達瑞公司；SLAN-96S全自動qPCR儀購自上海宏石公司；Eppendorf移液槍購自德國Eppendorf公司；Vortex-Genie2 漩渦混合器購自美國Scientific Industries公司；Magen磁珠血液快速提取試劑盒購自廣州美基公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取及擴增 所有標本檢測和儀器操作均嚴格按照廠家說明書和相應儀器的標準作業程序進行。(1)MALDI-TOF MS檢測系統：采用Magen磁珠血液快速提取試劑盒和Smart32半自動核酸提取儀提取HPV-DNA。核酸擴增使用Applied Biosystems Veriti 384 qPCR擴增儀，根據廠商試劑說明書設置相應反應程序，采用MALDI-TOF MS檢測系統對擴增好的產物進行HPV分型檢測。(2)之江檢測系統：采用上海之江核酸提取試劑和擴增試劑在Autrax全自動核酸提取工作站進行HPV-DNA提取和加樣，SLAN-96S全自動qPCR儀用于核酸擴增；(3)Cobas4800檢測系統：使用Cobas4800核酸提取和擴增試劑在Cobas x480全自動核酸提取儀進行HPV-DNA提取和加樣，核酸擴增在Cobas z480 qPCR儀上進行。

1.3.2準確度評價 采用MALDI-TOF MS檢測系統對隨機選取的40份宮頸脫落細胞標本的18種HR-HPV型別進行檢測，將其檢測結果與Sanger測序法結果進行比對，通過比較二者檢測結果的一致性，分析MALDI-TOF MS檢測結果的準確性。

1.3.3檢測下限評價 取18種HPV型別重組質粒(購自廣州達瑞診斷公司)，原濃度106copy/mL進行10倍梯度稀釋，最終得到105、104、103、102、10 copy/mL，共5個濃度梯度，18種型別每個梯度重復檢測10次。評價每個梯度各個型別的檢出情況。根據《人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測及基因分型、試劑技術審查指導原則》[2]關于檢測下限的標準，10次擴增結果檢出的總陽性符合率為100.00%，則符合標準。

1.3.4精密度評價 依據《人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測及基因分型、試劑技術審查指導原則》[2]精密度評價標準，選取HPV16、18型2個型別的陽性參考品(每份參考品均稀釋成104、102copy/mL 2個濃度梯度)和1份陰性參考品，分別代表強陽性、臨界陽性和陰性標本進行質譜檢測分析，每個型別每天檢測2次，連續測定5 d。評價2個HPV型別檢測的批間精密度；各型別同一批次檢測10次，評價2個型別檢測的批內精密度。

1.3.5抗交叉反應能力評價 將常見的HPV型別(如HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81型和CP8304、83型)及種屬相近或引起癥狀相似的其他病原體(如沙眼衣原體、解脲脲原體、單純皰疹病毒2型、巨細胞病毒、梅毒螺旋體、淋球菌、白色念珠菌、陰道毛滴蟲等)加入到10份HPV檢測結果為陰性的標本內進行擴增，每個標本重復檢測3次，評價外源性干擾物對質譜分析結果的影響。

1.3.6方法學比較 根據各廠商說明書對初篩選取的347份宮頸脫落細胞標本進行檢測，記錄3種方法的檢測結果，比較3種檢測結果的一致性。以Cobas4800檢測系統的結果為參考，判斷MALDI-TOF MS和之江檢測系統的靈敏度、特異度。

1.4統計學處理 采用SPSS23.0統計軟件進行數據處理分析。使用Kappa值比較3種檢測方法的一致性[Kappa值大小所代表的一致性強弱分為6個區段：一致性弱(<0.00)，一致性微弱(0.00～0.20)，一致性弱(>0.20～0.40)，中度一致(>0.40～0.60)，高度一致(>0.60～0.80)及一致性極強(>0.80～1.00)]，95%CI用于估算Kappa值的二項分布[2-3]；使用Mcnemar檢驗計算P值，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13種HR-HPV檢測方法比較 3種方法中，MALDI-TOF MS檢測限最低，為100 copy/mL，之江檢測系統檢測限最高，為10 000 copy/mL。Cobas 4800檢測系統能夠檢測14種HR-HPV型別但僅能對HPV16型和HPV18型進行分型；之江檢測系統能對15種HR-HPV進行分型測定；MALDI-TOF MS檢測系統可對18種HR-HPV進行分型測定。由于3種方法對HR-HPV的檢測型別略有差異，以下僅對14種HR-HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)檢測結果進行比較，且對16型和18型結果單獨分析，其他12種型別進行合并分析。

2.2MALDI-TOF MS準確度評價 MALDI-TOF MS檢測系統與Sanger測序法對40份宮頸脫落細胞標本的18種HR-HPV型別檢測的準確度為100.00%，檢測結果完全一致，具體檢測型別見表1。

表1 MALDI-TOF MS準確度驗證結果

2.3MALDI-TOF MS檢測下限評價 使用18種HR-HPV重組質粒為模板，核酸質譜檢測顯示1～2個目標峰，代表特定HPV型別的擴增產物和未延伸引物，各個型別之間不產生交叉反應。18種HPV型別中HPV26、33、45和56型在103copy/mL的檢出率為100.00%(10/10)，HPV16、18、31、35、39、51、52、53、58、59、66、68、73和82型在102copy/mL的檢出率為100.00%(10/10)。結果顯示18種型別的HPV檢測下限均在102～103copy/mL。

2.4MALDI-TOF MS精密度評價 HPV16型和HPV18型2個型別在102copy/mL和104copy/mL的總檢出率均為100.00%(20/20)，批內和批間精密度均為100.00%(10/10)；陰性參考品的檢出率為0.00%，重復性為100.00%。表明該質譜檢測系統性能穩定，滿足HPV核酸的檢測要求。

2.5MALDI-TOF MS抗交叉反應能力評價 10份陰性標本加入干擾病原體擴增后，MALDI-TOF MS檢測結果仍為陰性，未出現特征峰，陰性符合率為100.00%(10/10)，表明該檢測方法對非本試劑盒檢測的病原體無交叉反應，具有良好的特異度。

2.6臨床標本檢測符合率 采用MALDI-TOF MS檢測系統對347份標本檢測的陽性率為62.54%(217/347)，之江檢測系統陽性率為61.10%(212/347)，Cobas4800檢測系統陽性率為64.27%(223/347)。3種方法檢測的總符合率為92.51%(321/347)，其中有306份標本基因型檢測完全一致(88.18%)。Cobas4800和之江檢測結果的符合率最低，為92.22%(320/347)，Cobas4800與MALDI-TOF MS檢測系統結果的符合率為94.81%(329/347)，之江和MALDI-TOF MS檢測系統的符合率最高，為96.83%(336/347)。3種方法對HPV16型和HPV18型檢測的總符合率為98.56%和97.12%，其中之江和MALDI-TOF MS檢測系統對HPV16、18型的檢測符合率高達98.85%(Kappa=0.965，95%CI0.932～0.993)和98.27%(Kappa=0.917，95%CI0.852～0.982)。見表2。

表2 臨床標本檢測結果(n)

2.7靈敏度和特異度評價 MALDI-TOF MS檢測系統的靈敏度為94.62%，特異度為95.16%，均高于之江檢測系統(靈敏度為91.48%，特異度為93.55%)。

3 討 論

HR-HPV的持續感染與宮頸上皮病變密切相關，及時篩查HR-HPV分型是預防宮頸癌的重要手段。HPV16型與HPV18型不僅在世界范圍內高發，也是發生宮頸癌風險程度最高的2種型別。有研究表明，其他型的HR-HPV感染與地域分布密切相關，例如在亞洲地區，HPV52、58型的感染率較高；而在南美等地區，HPV31型更為流行；此外HPV33、45型是非洲地區的高發感染型別[3-5]，因此對HR-HPV進行基因分型檢測和地區流行性調查，對HR-HPV感染的風險程度判斷、疫苗研發有重要作用。本研究中Cobas4800檢測系統雖可一次性檢測94份標本，但只能區分HPV16、18型具體分型，不能區分其他高危型別；之江檢測系統雖能對15種HR-HPV型別進行全部分型但只能單次檢測22份標本。以二代基因測序為代表的高通量測序技術，因其檢測成本高、周期長、質控難、操作復雜、可重復性不高等因素限制了其在臨床上的大規模應用[6]。新興的MALDI-TOF MS檢測系統填補了中通量HPV-DNA檢測的空缺，又能實現準確、快速、經濟的HPV-DNA多基因多位點檢測[7]，本研究使用的MALDI-TOF MS HR-HPV檢測系統可在10 h內實現單次檢測192份標本，并對這些標本的18種HR-HPV準確分型。

對一個新的檢測系統進行性能驗證是保證檢測質量的重要基礎，本研究依據《人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測及基因分型、試劑技術審查指導原則》和相關研究報道[8-10]對MALDI-TOF MS檢測系統進行了準確度、精密度、檢測下限和抗交叉反應能力的性能驗證。研究結果顯示MALDI-TOF MS檢測系統對于18種HR-HPV檢測的準確度為100.00%，檢測下限在102～103copy/mL，靈敏度較高。在抗交叉反應能力試驗中，MALDI-TOF MS檢測系統對非本試劑盒檢出范圍內的常見HPV型別與種屬相近或引起癥狀相似的其他病原體無交叉反應，表明該法特異度較高，可滿足臨床和科研對HR-HPV的分型檢測需求。

本研究挑選了347份臨床標本對MALDI-TOF MS檢測系統和2種常用的qPCR檢測系統進行了比較。3種方法對347份臨床標本檢測的陽性率在61.10%～64.27%，其中Cobas4800檢測系統的陽性率最高(64.27%)，之江檢測系統陽性率最低(61.10%)，可能與檢測限的設定有關。本研究標本的陽性率偏高，主要原因在于本研究對HPV標本的結果進行了初步篩選，選擇了一定比例的HPV16、18型陽性結果的標本。在已測標本符合率的評價中，3種方法對于HPV16型檢測符合率均高于HPV18型，并且結果顯示3種HPV檢測方法具有高度一致性，其中之江和MALDI-TOF MS檢測系統對HR-HPV分型檢測結果的符合率最高，Cobas4800和之江檢測系統的符合率最低。目前，由于缺乏真正的HPV檢測金標準，評估新的HPV檢測方法的研究通?；谂c已建立的試驗方法的比較及與疾病終點的相關性評估[11-13]。Cobas4800 HPV檢測是新開發的HPV檢測試劑盒分析性能評價的參考方法[13-16],故本研究采用Cobas4800為參比方法，比較之江檢測系統和MALDI-TOF MS檢測系統這2種檢測系統檢測結果的靈敏度和特異度。結果顯示MALDI-TOF MS檢測系統的靈敏度和特異度均高于之江檢測系統。BUSP等[8]發現基于MALDI-TOF MS檢測系統檢測18種HR-HPV分型的檢測方法具有更高的靈敏度和特異度，本研究結論與之相符，但其研究僅涉及MALDI-TOF MS檢測系統的建立及對臨床標本的分析性能評價，并未對MALDI-TOF MS檢測系統進行性能驗證。本研究不僅涉及MALDI-TOF MS檢測系統對臨床HPV標本檢測的分析性能評價，且對MALDI-TOF MS檢測系統進行了系統的性能驗證。

本研究的不足之處在于僅對MALDI-TOF MS檢測系統做了分析性能評價，未結合標本的病理學結果進行臨床應用評價，且由于標本量的限制和方法普及程度無法使用Digene Hybrid Capture 2等已有的參考方法進行驗證。今后擬擴大樣本量并結合臨床病理學檢測結果對MALDI-TOF MS檢測系統的臨床應用和性能進行評價。本研究對MALDI-TOF MS檢測系統進行了分析性能驗證和方法的一致性評價，以期為基于MALDI-TOF MS檢測系統開發病原體傳染性疾病體外診斷試劑盒的性能研究和臨床應用評價提供參考依據