二甲雙胍聯合吉西他濱對胰腺癌細胞增殖、遷移及上皮間質轉化的影響

王文婷，彭釗，鄧祖亮，周軒，劉力

湘南學院附屬醫院，湖南郴州423000

胰腺癌是臨床常見的一種消化系統惡性腫瘤，由于其起病隱匿，癥狀和體征不典型，確診時往往已錯過了根治性手術的最佳時機［1-2］。有研究報道，僅有20%的胰腺癌患者能夠從根治性手術中獲益，但其術后5 年生存率仍不足5%［3］。因此，探索胰腺癌有效的治療策略一直是近年研究的熱點。吉西他濱是一種嘧啶核苷類似物，是美國食品和藥物管理局批準的一線抗腫瘤藥物，可通過抑制核苷酸還原酶和DNA 聚合酶而發揮抗腫瘤作用。吉西他濱作為晚期胰腺癌的標準一線治療藥物在臨床上已應用二十余年，但其化療效果并不理想［1］。二甲雙胍一直是糖尿病的一線治療藥物。近年研究發現，二甲雙胍能夠通過抑制有絲分裂繼而抑制細胞分裂，從而抑制腫瘤細胞增殖；還可通過降低循環胰島素水平，阻礙胰島素/胰島素樣生長因子1 軸的促腫瘤作用［4-5］。因此，二甲雙胍被認為是目前最有前途的腫瘤治療佐劑。但二甲雙胍能否使胰腺癌吉西他濱化療獲益尚不清楚。2020 年3 月—10 月，本研究探討了二甲雙胍聯合吉西他濱對胰腺癌細胞增殖、遷移及上皮間質轉化的影響?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 胰腺癌細胞株PANC-1（以下稱PANC-1細胞），購自美國菌種保藏中心。吉西他濱、二甲雙胍無菌粉末，純度均＞95%，購自美國Sigma 公司。Multiskan FC 基本型酶標儀，購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；IX70-81FZ 型倒置相差顯微鏡，購自日本Olympus 公司。MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、GAPDH 一抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養與藥物干預 將PANC-1 細胞接種于含10% FBS 和1%青鏈霉素的DMEM 培養基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養24 h。待細胞生長融合超過80%時，按1∶3 傳代。取傳2代以上、對數生長期、生長狀態良好的PANC-1 細胞，接種于96 孔板，然后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。待細胞生長融合60%左右時，一部分加入適量二甲雙胍，使二甲雙胍終濃度分別為0、5、10、20、40 mmol/L，繼續培養24 h；一部分加入適量吉西他濱，使吉西他濱終濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L，繼續培養24 h。

1.3 細胞增殖能力檢測 采用MTT法。不同終濃度二甲雙胍和吉西他濱干預24 h，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，然后每孔加入DMSO 150 μL，慢慢震蕩混勻，使結晶充分溶解。酶標儀于570 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值，計算細胞增殖活性。細胞增殖活性=實驗孔OD570值/對照孔OD570值×100%。每個濃度設6 個復孔，實驗重復3 次，取平均值。以能夠使細胞增殖活性降至50%左右時的二甲雙胍和吉西他濱濃度進行后續實驗。

1.4 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。取傳2 代以上、對數生長期、生長狀態良好的PANC-1細胞，接種于96孔板，隨機分為正常對照組、二甲雙胍組、吉西他濱組、聯合用藥組，然后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。待細胞生長融合60%左右時，用10 μL 移液器吸頭垂直于孔板制作“一”字劃痕，PBS 沖洗去除不貼壁細胞，倒置相差顯微鏡下拍照，記錄0 h 劃痕寬度。然后二甲雙胍組、吉西他濱組、聯合用藥組加入適量二甲雙胍或（和）吉西他濱，正常對照組加入等量培養基，37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養24 h，倒置相差顯微鏡下拍照，記錄24 h 劃痕寬度。根據公式計算細胞遷移率，細胞遷移率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.5 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。取傳2 代以上、對數生長期、生長狀態良好的PANC-1 細胞，接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。待細胞生長融合60%左右時，二甲雙胍組、吉西他濱組、聯合用藥組加入適量二甲雙胍或（和）吉西他濱，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。培養24 h，收集細胞，RIPA 裂解液充分裂解，提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量合格，可用于后續實驗。然后加入上樣緩沖液，水浴變性。取變性蛋白50 μg，SDS-PAGE 分離蛋白。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF 膜上。取出PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉，分別加入E-cadherin、Vimentin、GAPDH 一抗（稀釋比均為1∶1 000），孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（稀釋比為1∶3 000），室溫孵育，增強型化學發光檢測試劑盒化學發光，化學發光成像系統拍照，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH 為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3 次，取平均值。

1.6 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料以±s表示，結果比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni 校正法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍和吉西他濱對PANC-1 細胞增殖活性的影響 經0、5、10、20、40 mmol/L二甲雙胍干預，PANC-1 細胞增殖活性分別為（100.0 ± 3.0）%、（90.5±10.3）%、（75.6±15.0）%、（46.3±16.9）%、（33.6±4.2）%，隨著二甲雙胍濃度升高，PANC-1細胞增殖活性逐漸降低，呈濃度依賴性（F=29.14，P＜0.01）。20 mmol/L 二甲雙胍干預時，PANC-1 細胞增殖活性降至50%左右，故以20 mmol/L 二甲雙胍進行后續實驗。

經0、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L 吉西他濱干預，PANC-1 細胞增殖活性分別為（100.0 ± 7.5）%、（86.7 ± 9.1）%、（68.2 ± 8.6）%、（55.1 ± 7.0）%、（35.2±5.4）%，隨著吉西他濱濃度升高，PANC-1細胞增殖活性逐漸降低，呈濃度依賴性（F=66.88，P＜0.01）。0.4 μmol/L 吉西他濱干預時，PANC-1 細胞增殖活性降至50%左右，故以0.4 μmol/L 吉西他濱進行后續實驗。

2.2 各組細胞遷移能力比較 正常對照組、二甲雙胍組、吉西他濱組、聯合用藥組細胞遷移率分別為（99.93 ± 1.09）%、（77.36 ± 6.32）%、（71.00 ±5.29）%、（37.82±2.55）%。二甲雙胍組、吉西他濱組、聯合用藥組細胞遷移率均低于正常對照組，聯合用藥組細胞遷移率均低于二甲雙胍組、吉西他濱組（P均＜0.05）。而二甲雙胍組與吉西他濱組細胞遷移率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組E-cadherin、Vimentin 蛋白表達比較 見表1。

表1 各組E-cadherin、Vimentin蛋白相對表達量比較（±s）

表1 各組E-cadherin、Vimentin蛋白相對表達量比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與二甲雙胍組比較，#P＜0.05；與吉西他濱組比較，△P＜0.05。

Vimentin 組別E-cadherin 1.000±0.027 0.857±0.059*0.840±0.057*0.548±0.053*#△正常對照組二甲雙胍組吉西他濱組聯合用藥組1.100±0.111 1.311±0.091*1.345±0.049*2.121±0.052*#△

3 討論

胰腺癌是一種惡性程度非常高的消化系統惡性腫瘤，近年來其發病率在國內外均呈明顯上升趨勢。胰腺癌起病隱匿，癥狀和體征不典型，確診時往往已錯過了根治性手術的最佳時機［1-2］。臨床研究證實，胰腺癌患者即使能夠接受根治性手術，術后也必須接受輔助化療，才能進一步提高生存期［6］。

吉西他濱是一種嘧啶核苷類似物，是目前治療胰腺癌最常用的化療藥物［7］，不僅能緩解胰腺癌癥狀，提高患者生活質量，還能延長患者生存期。但吉西他濱作為治療晚期胰腺癌的標準一線藥物臨床應用已有二十余年，在化療過程中易產生獲得性耐藥，導致其化療效果并不理想［1，8］。因此，提高胰腺癌細胞對吉西他濱的化療敏感性是提高其化療效果的重要措施。

二甲雙胍是2 型糖尿病的一線治療藥物。近年研究發現，二甲雙胍能夠顯著抑制乳腺癌、肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤進展，具有顯著地抗腫瘤作用。在人類各種腫瘤中，通常存在磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路表達不平衡，該信號通路異常激活可導致細胞增殖和分化異常，從而引起腫瘤的發生、發展［9-10］。有研究報道，吉西他濱的耐藥機制與PI3K 信號通路異常調節有關。YOSHIDA 等［11］研究報道，二甲雙胍能夠通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，提高耐藥腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。越來越多證據表明，二甲雙胍對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用，并且聯合其他化療藥物能夠明顯提高化療效果，被認為是目前最有前途的腫瘤治療佐劑［12-15］。由此推測，二甲雙胍有可能提高胰腺癌細胞對吉西他濱的化療敏感性，但目前相關報道較少。

本研究結果發現，隨著二甲雙胍和吉西他濱濃度升高，PANC-1 細胞增殖活性逐漸降低，呈濃度依賴性，提示二甲雙胍和吉西他濱對胰腺癌細胞增殖均具有一定抑制作用。本研究選擇能夠使胰腺癌細胞增殖活性降至50%左右時的二甲雙胍和吉西他濱濃度進行后續實驗，結果發現，二甲雙胍組、吉西他濱組、聯合用藥組細胞遷移率均低于正常對照組，聯合用藥組細胞遷移率均低于二甲雙胍組、吉西他濱組，而二甲雙胍組與吉西他濱組細胞遷移率比較差異無統計學意義。結果提示二甲雙胍能夠提高胰腺癌細胞對吉西他濱的化療敏感性。

腫瘤局部浸潤、遠處轉移和化療耐藥是胰腺癌患者預后較差的主要原因，而這些原因均與上皮間質轉化密切相關。上皮間質轉化的主要特征是上皮標志物（如E-cadherin）丟失和間充質標志物（如Vimentin）增加。有研究報道，二甲雙胍能夠通過靶向癌相關成纖維細胞抑制上皮間質轉化，從而抑制胰腺癌細胞侵襲和遷移［16-17］。本研究結果發現，二甲雙胍組、吉西他濱組、聯合用藥組E-cadherin、Vimentin 蛋白相對表達量均低于正常對照組，聯合用藥組E-cadherin、Vimentin 蛋白相對表達量均低于二甲雙胍組、吉西他濱組；而二甲雙胍組與吉西他濱組E-cadherin、Vimentin蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義。提示二甲雙胍聯合吉西他濱能夠上調胰腺癌細胞E-cadherin 蛋白表達、下調Vimentin 蛋白表達，即二者聯合可顯著抑制胰腺癌細胞上皮間質轉化。因此，在含有吉西他濱的化療方案中加入一定劑量的二甲雙胍可能是一種比較有前途的胰腺癌化療策略。

綜上所述，二甲雙胍聯合吉西他濱能夠抑制胰腺癌細胞增殖、遷移及上皮間質轉化，提高胰腺癌細胞對吉西他濱的化療敏感性。但二者聯合的具體作用機制還需進一步探索。