膠質瘤組織lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表達變化及其臨床意義

王寧，于海，宋千，廉民學，鮑剛，何百祥

西安交通大學第一附屬醫院，西安710061

膠質瘤是中樞神經系統常見的腫瘤之一，以WHO 中樞神經系統腫瘤分類Ⅲ、Ⅳ級多見［1］。手術切除聯合術后放化療或免疫治療是膠質瘤最常見的治療手段，但其治療后短期復發轉移率高，患者預后較差，中位生存期一般不超過15個月［2-3］。膠質瘤的發病部位較為特殊，臨床表現無特異性，CT、MRI 等影像學檢查亦缺乏特征性，故其術前診斷困難。因此，尋找靈敏度高、特異度強的膠質瘤分子標志物對其早期診斷和靶向治療具有重要意義。HOXA 反義轉錄物髓系異構體1（HOTAIRM1）是人類7 號染色體上的一種長鏈非編碼RNA（lncRNA），雖然不編碼蛋白質，但可通過調控基因的表達參與細胞轉錄和翻譯過程，如通過上調內質網分子伴侶GRP78 表達，幫助蛋白正確折疊，從而促進細胞生存并抑制其凋亡［4］。有研究報道，lncRNA HOTAIRM1 表達失調可介導胃癌的發生、發展［5］。微小RNA（miRNA）是一類具有轉錄后調節活性的內源性小分子RNA，能夠與靶基因mRNA 的3′端非編碼區特異性結合，從而降解靶基因mRNA 或抑制其翻譯，進而在細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程中發揮重要作用［6］。miR-129-5p 是miRNA 家族成員之一。有研究報道，子宮內膜癌、膀胱癌組織miR-129-5p 表達下調，且其表達變化與患者臨床病理特征密切相關［7-8］。但目前關于lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p在膠質瘤組織中表達變化的報道較少。2014年5月—2017年5月，本研究觀察了膠質瘤組織lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 表達變化，并探討其臨床意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期西安交通大學第一附屬醫院收治的膠質瘤患者83例（觀察組），均經術后組織病理學檢查證實。納入標準：①符合膠質瘤診斷標準；②首次確診；③接受外科手術治療，術前未接受任何抗腫瘤治療；④預計生存期超過6個月；⑤病歷資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②伴有顱內其他疾病者；③合并心、肝、腎等重要臟器功能不全者；④妊娠期或哺乳期婦女。其中，男51 例、女32 例，年齡26～77（55.62 ± 8.23）歲，BMI 19～26（22.08 ± 2.12）kg/m2，合并高血壓21 例、糖尿病18 例、高脂血癥15例；腫瘤位置：顳部45例，額部38例；腫瘤直徑：＜4 cm 39例，≥4 cm 44例；病理類型：星形細胞瘤49 例，膠質母細胞瘤34 例；WHO 分級：Ⅰ、Ⅱ級53例，Ⅲ、Ⅳ級30例。

同期選擇因顱腦損傷在西安交通大學第一附屬醫院接受外科手術治療者55例（對照組），手術切除組織經組織病理學檢查證實為正常腦組織。其中，男34 例、女21 例，年齡25～78（53.49 ± 8.70）歲，BMI 19～25（22.34 ± 2.05）kg/m2，合并高血壓13例、糖尿病11例、高脂血癥8例。

兩組性別、年齡、BMI、合并癥等臨床資料具有可比性。本研究經西安交通大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 表達 檢測采用RT-qPCR 法。取手術切除的膠質瘤組織和正常腦組織，液氮下研磨成粉末狀，按TRIzol 說明提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，總RNA 的濃度和純度合格。 按PrimeScipt RT Reagent Kit 說明將總RNA 逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR 擴增。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。lncRNA HOTAIRM1上游引物：5"-CCCACCGTTCAATGAAAG-3"，下游引物5"-GTTTCAAACACCCACATTTC-3′；miR-129-5p上游引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG?GT-3"，下游引物5"-ATTCGCACTGGATACGACG?CAAGC-3"；U6 上游引物5"-GCACCGTCAAGGCT?GAGAAC-3"，下游引物5"-TGGTGAAGACGCCAGT?GGA-3"。PCR 擴增體系共20 μL：SYBR Premix Ex Tap Ⅱ9 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.8 μL，無酶蒸餾水7.4 μL；反應條件：95 ℃變性60 s，95 ℃變性20 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s 共36 個循環。以U6 為內參，采用2-ΔΔCT 法計算lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 膠質瘤患者術后采用門診復查或電話形式定期隨訪。術后第1年每隔3個月隨訪1次，術后第2年每隔6個月隨訪1次，術后第3年隨訪1次，共隨訪3 年。終點事件為患者死亡或隨訪結束，統計患者生存時間。

1.4 統計學方法 采用SAS9.4統計軟件。計量資料以±s表示，兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson 積矩相關分析法。生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 表達比較 觀察組與對照組lncRNA HOTAIRM1 相對表達量分別為2.36 ± 0.19、1.12 ± 0.25，miR-129-5p 相對表達量分別為0.37±0.12、0.83±0.11。觀察組lncRNA HOTAIRM1 相對表達量高于對照組，miR-129-5p 相對表達量低于對照組（t分別為33.046、22.785，P均＜0.05）。

2.2 膠質瘤組織lncRNA HOTAIRM1 表達與miR-129-5p表達的關系 Pearson積矩相關分析顯示，膠質瘤組織lncRNA HOTAIRM1相對表達量與miR-129-5p相對表達量呈負相關關系（r=-0.726，P＜0.05）。

2.3 膠質瘤組織lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表達與患者臨床病理特征的關系 分別以膠質瘤組織lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p相對表達量的中位數（1.93、0.45）為臨界值，將患者分為lncRNA HOTAIRM1 低表達者40 例與lncRNA HOTAIRM1 高表達者43例、miR-129-5p低表達者46例與miR-129-5p高表達者37例。不同lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表達與膠質瘤患者臨床病理特征的關系見表1。

2.4 膠質瘤組織lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表達與患者生存時間的關系 lncRNA HOTAIRM1高表達者累積生存時間為16.22（95%CI：14.06～18.38）個月，lncRNA HOTAIRM1 低表達者為20.91（95%CI：18.93～22.89）個月，lncRNA HOTAIRM1高表達者累積生存時間低于lncRNA HOTAIRM1 低表達者（χ2=10.836，P＜0.05）。miR-129-5p高表達者累積生存時間為23.07（95%CI：21.52～24.62）個月，miR-129-5p 低表達者為18.10（95%CI：15.36～19.85）個月，miR-129-5p高表達者累積生存時間高于miR-129-5p低表達者（χ2=12.015，P＜0.05）。見圖1、2。

3 討論

膠質瘤是臨床常見的一種顱內原發性腫瘤，其發病率不斷上升。隨著現代醫學技術的發展，膠質瘤的治療手段不斷優化和改進，但患者預后仍不理想，5 年生存率較低。膠質瘤的發病部位較為特殊，臨床表現無特異性，CT、MRI 等影像學檢查亦缺乏特征性，故其術前診斷困難。因此，尋找靈敏度高、特異度強的膠質瘤分子標志物對其早期診斷和靶向治療具有重要意義。

有研究報道，膠質瘤發病與體內促癌基因激活和抑癌基因失活密切相關［9］。lncRNA 是一類內源性非編碼RNA，可從多個層面參與細胞生物學功能調控。近年研究發現，lncRNA 還可作為促癌基因或抑癌基因參與多種惡性腫瘤的發生、發展。ZONG等［10］研究發現，胃癌細胞lncRNA H19 表達上調，其表達上調能夠激活p53，從而促進胃癌細胞增殖并抑制其凋亡。ZHANG 等［11］研究報道，HOX 轉錄反義RNA 在結腸癌、乳腺癌、肝癌中異常表達，可通過招募Polycomb 抑制復合物2 至抑癌基因位置，從而抑制抑癌基因表達，進而促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡。HOTAIRM1是lncRNA家族成員之一，可介導多種惡性腫瘤的發生、發展。江梅等［12］研究報道，HOTAIRM1 在非實體瘤中發揮抑癌作用，可通過介導腫瘤增殖相關信號通路影響細胞增殖、分化，進而誘發急性髓系白血病。程磊等［13］研究報道，HOTAIRM1 表達失調可參與膠質瘤的發病過程，但該研究未探討其表達與患者臨床病理特征和預后的關系。本研究結果發現，與對照組比較，觀察組lncRNA HOTAIRM1 表達上調，提示lncRNA HOTAIRM1 能夠參與膠質瘤的發生、發展，其作用機制可能是lncRNA HOTAIRM1 與Polycomb 特異性結合后抑制多梳抑制復合物2 和組蛋白去甲基化酶UTX/MLL 活性，通過調節染色質構象進而影響HOXA1 基因簇的轉錄活性，從而促進膠質瘤的發生、發展［14］。LI 等［15］研究表明，lncRNA HOTAIRM1特異性結合G9a、Zeste 基因增強子同源物2，通過影響H3K27、H3K9的去甲基化，降低DNA甲基化水平，最終促進膠質瘤細胞增殖、侵襲和遷移。本研究結果還發現，腫瘤直徑≥4 cm和WHO 分級Ⅲ、Ⅳ級的膠質瘤組織lncRNA HOTAIRM1 高表達的比例明顯增加，且lncRNA HOTAIRM1 高表達者累積生存時間明顯低于lncRNA HOTAIRM1 低表達者，提示lncRNA HOTAIRM1可作為評估膠質瘤患者病情進展和預后判斷的生物標志物。

表1 不同lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表達與膠質瘤患者臨床病理特征的關系［例（%）］

圖1 膠質瘤組織不同lncRNA HOTAIRM1表達者生存曲線

圖2 膠質瘤組織不同miR-129-5p表達者生存曲線

miR-129-5p 是miRNA 家族成員之一。有研究報道，miR-129-5p表達下調能夠促進原發性肝癌、前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤的發生、發展，并與腫瘤侵襲和轉移密切相關［16-19］。本研究觀察組miR-129-5p相對表達量明顯低于對照組，即miR-129-5p 可能作為一種抑癌基因參與膠質瘤的發生。有研究認為，miR-129-5p 的直接調控靶基因之一為TGIF2，miR-129-5p表達下調減弱了mRNA轉錄后和蛋白翻譯水平上對TGIF2 表達的抑制效應，而TGIF2 表達上調又能強化Wnt/β-catenin 信號通路，從而促進膠質瘤的發生、發展［20］。本研究結果還發現，腫瘤直徑≥4 cm和WHO分級Ⅲ、Ⅳ級的膠質瘤組織miR-129-5p低表達的比例明顯增加，并且miR-129-5p 低表達者累積生存時間明顯低于miR-129-5p 高表達者，提示miR-129-5p可作為評估膠質瘤患者病情進展和預后判斷的生物標志物。

本研究結果還發現，膠質瘤組織lncRNA HOTAIRM1相對表達量與miR-129-5p相對表達量呈負相關關系，推測lncRNA HOTAIRM1表達上調可能通過負調控miR-129-5p 導致其活性降低，進而使TGIF2表達上調，從而促進膠質瘤的發生、發展［16］。

綜上所述，膠質瘤組織lncRNA HOTAIRM1 表達上調、miR-129-5p表達下調，二者表達變化與腫瘤直徑、WHO 分級和患者預后密切相關。lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 有可能作為評估膠質瘤病情程度和預后判斷的生物標志物。