UPLC法測(cè)定清達(dá)顆粒和清眩降壓湯中黃芩苷的含量

林 珊，陳達(dá)鑫，蔡巧燕，張 鈴，陳靜雯，李金艷，彭 軍，褚劍鋒*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)陳可冀學(xué)術(shù)思想傳承工作室，福建 福州350122；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122；5.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州350122）

清眩降壓湯是陳可冀院士多年來用于治療高血壓的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由天麻、鉤藤、黃芩等十多味中藥組成，用于肝陽上亢的高血壓、缺血性腦血管病、眩暈等疾病［1-2］。清達(dá)顆粒由清眩降壓湯化裁而來，具有清熱瀉火、平肝潛陽作用，保留原方中黃芩、天麻、鉤藤，增加了具有清心、去熱作用的蓮子心［3］。前期研究發(fā)現(xiàn)，清眩降壓湯和清達(dá)顆粒均能降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓和抑制心腎大血管損害［4-6］。而且2個(gè)復(fù)方均能促進(jìn)血管舒張，且清達(dá)顆粒的舒張作用明顯優(yōu)于清眩降壓湯［7］。為明確其中的主要藥效成分以及確保臨床療效［8］，應(yīng)建立清達(dá)顆粒的質(zhì)量控制體系。本文通過超高效液相色譜法測(cè)定和比較清達(dá)顆粒和清眩降壓湯中指標(biāo)性成分黃芩苷的含量［9］，初步揭示2個(gè)復(fù)方控制血壓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為建立清達(dá)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和臨床實(shí)驗(yàn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AR2130電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；CP225D電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ-300DB臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 清達(dá)顆粒（批號(hào)20170309、20170329、20170405，江陰天江藥業(yè)有限公司）；清眩降壓湯顆粒（批號(hào)1701301、1701326、1701425，江陰天江藥業(yè)有限公司）；黃芩苷（批號(hào)B20570，上海源葉生物科技有限公司），純度大于98.0%；乙腈、甲醇（色譜純，德國MERCK公司），其余試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱定黃芩苷對(duì)照品，加入適量甲醇，溶解成對(duì)照品儲(chǔ)備液，其濃度為0.5 mg／mL。精密吸取適量儲(chǔ)備液，加入甲醇稀釋，搖勻，得黃芩苷對(duì)照品溶液0.05 mg／mL。

2.1.2 供試品溶液制備 稱取清達(dá)顆粒0.1 g和清眩降壓湯0.2 g，分別置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱重；超聲提取20 min，放冷，再稱重，用甲醇補(bǔ)重后，搖勻，取其上清液，0.22μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件的選擇與優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相選擇 選擇2組不同流動(dòng)相系統(tǒng)：乙腈-水和乙腈-0.05%磷酸。取清達(dá)顆粒供試品溶液，分別以2種流動(dòng)相梯度洗脫。結(jié)果表明，當(dāng)乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，黃芩苷的出峰時(shí)間為5.73 min，色譜峰的分離效果不好，分離度小，雜質(zhì)峰多，峰型不理想。采用乙腈-0.05%磷酸時(shí)，黃芩苷的出峰時(shí)間7.10 min，分離度達(dá)到要求，未有雜峰。故選用乙腈-0.05%磷酸。

2.2.2 檢測(cè)波長選擇 選擇3個(gè)不同的檢測(cè)波長220、280和300 nm。280 nm下所得色譜圖的色譜峰分離度較好，雜峰較少。黃芩苷色譜峰紫外吸收較大，響應(yīng)值高，基線較平穩(wěn)，故選用280 nm作為檢測(cè)波長。

2.2.3 色譜條件 色譜柱Acclaim UPLC RSLC 120 C18（2.1 mm×100 mm，2.2μm）；流動(dòng)相乙腈-0.05%磷酸梯度洗脫，梯度程序：0～20 min，2%～80%乙腈；流速0.4 mL／min；柱溫30℃；檢測(cè)波長280 nm。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 參照前期研究結(jié)果［9］，取黃芩苷對(duì)照品溶液，分別配制0.01、0.02、0.03、0.05、0.07 和0.10 mg／mL進(jìn)樣，記錄黃芩苷色譜峰的峰面積。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝11 736x＋33.196（r2＝0.999），說明黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品在0.01～0.1 mg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取黃芩苷對(duì)照品溶液（0.05 mg／mL），進(jìn)樣量2μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算黃芩苷的RSD。結(jié)果表明，黃芩苷RSD為0.39%，說明本實(shí)驗(yàn)所建立方法的精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取清達(dá)顆粒（批號(hào)201703 09）6份和清眩降壓湯（批號(hào)1701301）6份，按上述供試品溶液方法制備，進(jìn)樣量2μL，記錄色譜峰峰面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得黃芩苷峰面積RSD分別為2.50%和2.89%，表明該實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取清達(dá)顆粒（批號(hào)201703 09）和清眩降壓湯（批號(hào)1701301），按上述供試品溶液方法制備，在0、2、4、6、12和24 h分別進(jìn)樣2μL，記錄色譜峰峰面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得黃芩苷RSD分別為0.69%和0.66%，說明方法的穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別取0.1 g清達(dá)顆粒和0.2 g清眩降壓湯樣品各9份，按照一定比例（樣品中含有的黃芩苷∶黃芩苷對(duì)照品＝1∶0.5、1∶1、1∶2），加入一定量的黃芩苷對(duì)照品溶液制備成供試液，每種比例各制備3份。2μL進(jìn)樣，記錄色譜峰的峰面積，計(jì)算回收率。黃芩苷在清達(dá)顆粒中的回收率為94.78%，RSD為2.58%，黃芩苷在清眩降壓湯中的回收率為94.56%，RSD為2.16%，說明該樣品回收率良好，結(jié)果見表1和表2。

表1 清達(dá)顆粒中含有的黃芩苷的回收率試驗(yàn)

表2 清眩降壓湯中含有的黃芩苷的回收率試驗(yàn)

2.3.6 供試品溶液的測(cè)定 取清達(dá)顆粒（批號(hào)20170309、20170329、20170405）和清眩降壓湯（批號(hào)1701301、1701326、1701425）各3批次，分別按照上述方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量2μL，記錄色譜峰的峰面積。結(jié)果黃芩苷含量分別為4.35 mg／g和0.83 mg／g，RSD分別為1.30%和2.06%。結(jié)果見表3、表4和圖1。

表3 清達(dá)顆粒的黃芩苷含量測(cè)定

表4 清眩降壓湯的黃芩苷含量測(cè)定

注：A黃芩苷對(duì)照品；B清達(dá)顆粒；C清眩降壓湯；1黃芩苷。

3 討 論

在前期研究，我們發(fā)現(xiàn)黃芩苷作為清眩降壓湯主要成分之一［9］，其含量較大，色譜峰分離度好，因此選用黃芩苷作為清達(dá)顆粒和清眩降壓湯的指標(biāo)性成分。文獻(xiàn)報(bào)道黃芩苷具有抗高血壓的作用［10-11］，2個(gè)復(fù)方也都具有抗高血壓的藥效作用，并且清達(dá)顆粒的藥效要優(yōu)于清眩降壓湯。本研究結(jié)果可見，清達(dá)顆粒中黃芩苷的含量明顯高于清眩降壓湯，因此黃芩苷應(yīng)是清達(dá)顆粒和清眩降壓湯抗高血壓藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，已采用超高效液相色譜法對(duì)復(fù)方和黃芩藥材中黃芩苷進(jìn)行含量分析［12-13］。在色譜條件摸索過程中，對(duì)流動(dòng)相、檢測(cè)波長等參數(shù)進(jìn)行比較，確立最佳色譜條件，在一定時(shí)間內(nèi)2個(gè)復(fù)方中黃芩苷實(shí)現(xiàn)良好的分離。以乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，黃芩苷分離度較差，因此采用乙腈-0.05%磷酸進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果黃芩苷色譜峰得到了很好的分離，目標(biāo)峰突出，周圍雜峰相對(duì)較少，有利于復(fù)方中黃芩苷的檢測(cè)。

本研究方法準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好、便于操作，可用于測(cè)定清眩降壓湯和清達(dá)顆粒中主要成分黃芩苷的含量。建立以黃芩苷為指標(biāo)性成分的清達(dá)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，完善清達(dá)顆粒的質(zhì)控體系，為清達(dá)顆粒創(chuàng)新中藥的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。