柴胡疏肝散調(diào)節(jié)胰島素受體改善非酒精性脂肪肝模型大鼠脂代謝

鄭 琳，何順勇，程超威，張捷平

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州350004；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州350122）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌［1-2］。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，NAFLD屬“肝癖”“脅痛”“積聚”“痞滿(mǎn)”“痰濁”等范疇，肝郁氣滯、肝失疏泄為其主要病機(jī)［3］。大量臨床研究表明柴胡疏肝散加減論治對(duì)肝氣郁滯型NAFLD效果顯著，但其現(xiàn)代藥理機(jī)制仍未明確［4-6］。本研究以肝郁氣滯型NAFLD大鼠為模型，觀察柴胡疏肝散對(duì)大鼠肝組織胰島素受體及下游分子叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1A（forkhead box O1A，F(xiàn)OXO1A）表達(dá)及修飾的影響，以期初步闡明其涉及的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體SPF級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：2011000521084。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，5只／籠，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為26℃、相對(duì)濕度70%，實(shí)驗(yàn)過(guò)程除特殊要求以外，其余時(shí)間自由進(jìn)食、飲水、活動(dòng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 柴胡疏肝散組成：柴胡6 g，陳皮6 g，川芎5 g，香附5 g，枳殼5 g，白芍5 g，炙甘草3 g，購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院；易善復(fù)［賽諾菲安萬(wàn)特（北京）制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：9BJD031B］。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 高脂飼料（每100 g飼料中含1%膽固醇、20%豬油、4%蔗糖和75%普通飼料，閩侯縣上街鎮(zhèn)潤(rùn)怡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物服務(wù)部）；總膽固醇（total cholesterol，Tch）、甘油三酯（triglyceride，TG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20190320、20190318、20190323、20190330、20190325、20190316）；胰 島 素受體β（insulin receptorβ，InsR-β）抗體、磷酸化胰島素受 體β（pInsR-β）（Try1150／1151）抗體（美國(guó)Cell singaling公司，批號(hào)：#3020、#3021）；FOXO1A抗體、磷酸化叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1A（pFOXO1A）（S256）抗體（美國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab39670、ab131339）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器DU730型核酸蛋白分析儀（美國(guó)BACKMAN公司）；Mini Protean垂直電泳儀、化學(xué)發(fā)光顯像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

2 方 法

2.1 藥物制備 柴胡疏肝散中藥飲片以2倍體積蒸餾水浸泡0.5 h，文火煎煮，過(guò)濾濃縮，最終調(diào)整至含生藥量2 g／mL，高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆?。易善?fù)藥液用羥甲基纖維素配置為含藥量2 mg／mL懸濁液。

2.2造模、分組及干預(yù) 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量以隨機(jī)數(shù)字法分為正常組10只和造模組30只。正常組由普通飼料喂養(yǎng)，造模組由高脂飼料喂養(yǎng)，同時(shí)每天以細(xì)繃帶束縛四肢限制活動(dòng)8 h，持續(xù)10周，制備肝郁氣滯型NAFLD大鼠模型［7-8］。成模后大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組和中藥組。中藥組按7 g／（kg·d）予柴胡疏肝散藥液灌胃，西藥組按0.3 g／（kg·d）予易善復(fù)藥液灌胃，正常組、模型組予相同體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)給藥4周。

2.3 標(biāo)本采集4周后，各組大鼠禁食不禁水8 h，麻醉后采集腹主動(dòng)脈血液，分離血清于-20℃保存。取肝組織分別置于4%多聚甲醛、液氮保存。

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 動(dòng)物的一般狀態(tài) 觀察大鼠體質(zhì)量、活動(dòng)度、毛發(fā)、皮膚、進(jìn)食、糞便等一般情況。

2.4.2 血清檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，以酶法檢測(cè)血清Tch、TG、HDL和LDL，賴(lài)氏法檢測(cè)血清ALT和AST活力。

2.4.3 肝組織形態(tài)學(xué)觀察 取肝組織行石蠟包埋切片，用于蘇木素-伊紅（HE）染色進(jìn)行病理學(xué)觀察，光鏡下病理變化進(jìn)行分級(jí)評(píng)分。肝小葉清晰，肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯脂肪變性細(xì)胞，計(jì)0分；肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，可見(jiàn)少數(shù)脂肪空泡，以中、小空泡為主，累及肝細(xì)胞約1／3，符合病理+級(jí)，計(jì)1分；肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整，可見(jiàn)脂肪中、小空泡，受累細(xì)胞約1／2，符合病理++級(jí)，計(jì)2分；肝小葉邊界不清晰，肝索排列雜亂不規(guī)則，細(xì)胞出現(xiàn)大量玻璃樣、氣球樣性改變，累及肝小葉1／2以上，符合病理+++級(jí)，計(jì)3分。每個(gè)標(biāo)本以10個(gè)高倍鏡視（×200）觀察并計(jì)數(shù)積分，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4.4 Western blot檢測(cè)肝組織InsR-β、FOXO1A及其磷酸化蛋白表達(dá) 各組隨機(jī)選取5份肝組織，裂解細(xì)胞提取肝組織總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取30μg總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后，濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉，分別加入InsR-β（1∶1 000）、pInsR-β（1∶1 000）、FOXO1A（1∶1 000）、pFOXO1A（s256）（1∶1 000）、β-actin（1∶3 000）一抗，4℃搖動(dòng)孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光，Image J凝膠圖象軟件分析光密度值（IA）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用t或t'檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 4組大鼠一般情況觀察 與正常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)反應(yīng)和行為遲緩，多呈困倦狀態(tài)，食少；皮毛枯黃，無(wú)光澤；爪甲紫暗，尾巴呈棕紅色，部分出現(xiàn)鱗片；糞便干、少、小。與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠行為活躍，活動(dòng)增加，皮毛膚色有明顯改善。4組大鼠體質(zhì)量變化見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠體質(zhì)量比較（±s）g

表1 4組大鼠體質(zhì)量比較（±s）g

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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3.2 4組血脂指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。

表2 4組血脂指標(biāo)比較（±s）mmol／L

表2 4組血脂指標(biāo)比較（±s）mmol／L

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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3.3 4組血清ALT、AST活性比較 見(jiàn)表3。

3.4 4組肝組織HE染色病理變化及評(píng)分比較 光鏡下可見(jiàn)，正常組肝小葉清晰，肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯脂肪變性細(xì)胞；模型組中，肝小葉邊界不清晰，肝索排列雜亂不規(guī)則，細(xì)胞出現(xiàn)大量玻璃樣、氣球樣性改變，累及肝小葉1／2以上，符合病理+++級(jí)；中藥組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，可見(jiàn)少數(shù)脂肪空泡，以中、小空泡為主，累及肝細(xì)胞約1／3，符合病理+級(jí)；西藥組肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整，可見(jiàn)脂肪中、小空泡，受累細(xì)胞約介于1／3～1／2，介于病理+～++級(jí)。見(jiàn)圖1、表4。

3.5 4組大鼠肝組織InsR-β、FOXO1A及其磷酸化蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)圖2、表5。

表3 4組血清ALT、AST活性比較（±s）U／L

表3 4組血清ALT、AST活性比較（±s）U／L

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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表4 4組大鼠肝組織病理變化積分比較（±s）

表4 4組大鼠肝組織病理變化積分比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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圖1 4組肝組織HE染色圖（×200）

圖2 4組大鼠肝組織InsR-β、FOXO1A及其磷酸化蛋白電泳圖

表5 4組大鼠肝組織InsR-β、FOXO1A及其磷酸化蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 4組大鼠肝組織InsR-β、FOXO1A及其磷酸化蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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4 討 論

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，NAFLD病因病機(jī)主要由于情志不暢，肝失疏泄，致肝氣不舒，氣機(jī)郁滯，氣滯則血瘀，濕熱、濁邪、瘀血等內(nèi)郁于肝膽而發(fā)??；或飲食肥甘厚味，或脾虛失運(yùn)，清濁不化，致濕熱內(nèi)生，濕熱之邪阻滯經(jīng)絡(luò)。痰濁內(nèi)結(jié)，阻滯氣機(jī)，氣滯血瘀，瘀血內(nèi)停，阻滯脈絡(luò)，最終導(dǎo)致痰瘀互結(jié)。故在治療上應(yīng)當(dāng)分期論治，初期治療主要為疏肝理氣、健脾和胃；中后期治療主要為健脾益腎、化瘀散結(jié)，佐以清熱化濕［9］。

柴胡疏肝散出自《景岳全書(shū)》，由柴胡、川芎、香附、陳皮、枳殼、白芍、甘草等中藥組成，有疏肝解郁、行氣活血止痛之功效，臨床主要治療以脅肋疼痛、脘腹脹滿(mǎn)、脈弦為特征的肝氣郁結(jié)證。方中柴胡疏肝理氣、條達(dá)氣機(jī)，為君藥；臣以香附和川芎疏肝理氣、止痛活血；陳皮、枳殼理氣行滯和胃、祛濕化痰，甘草、芍藥養(yǎng)血柔肝、緩急止痛，上四味為佐使之用。臨床研究表明，柴胡疏肝散能有效降低肝氣郁結(jié)型NAFLD患者的TG、Tch和ALT、AST，有較好臨床療效［10-12］。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)高脂飼料聯(lián)合細(xì)繃帶束縛限制活動(dòng)，制備了肝氣郁結(jié)型NAFLD大鼠動(dòng)物模型。通過(guò)柴胡疏肝散灌胃治療4周，較模型組比較，血清TG、Tch、LDL和ALT、AST都有明顯下降，肝組織病理形態(tài)學(xué)明顯改善，提示柴胡疏肝散能有效逆轉(zhuǎn)肝氣郁結(jié)型NAFLD大鼠的血脂、肝損傷和脂肪變性。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為NAFLD是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，其與胰島素抵抗誘導(dǎo)的糖脂代謝紊亂關(guān)系密切［13-14］。細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)主要通過(guò)InsR-IRS1／2-PI3K／Akt通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄因子FOXO1是胰島素信號(hào)通路的下游蛋白，可以被Akt磷酸化修飾，從而調(diào)節(jié)活性。FOXO1去磷酸化狀態(tài)是其活性形式，能促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；相反，F(xiàn)OXO1磷酸化則抑制其轉(zhuǎn)錄活性，并從細(xì)胞核內(nèi)易位到細(xì)胞質(zhì)，靶基因的表達(dá)下降［15］。參與脂肪合成的基因如：固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰CoA羧化酶（ACC）等，都受FOXO1調(diào)控［15］。當(dāng)胰島素抵抗時(shí)，F(xiàn)OXO1磷酸化減少，轉(zhuǎn)錄活性增加，可能造成肝臟脂肪沉積；增加肝細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)FOXO1磷酸化，有效抑制活性，能改善肝脂肪代謝［16］。因此，胰島素抵抗與肝內(nèi)脂肪沉積互為因果，是NAFLD發(fā)病的標(biāo)志性因素。改善患者胰島素抵抗，是防治NAFLD的重要環(huán)節(jié)。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到模型組動(dòng)物肝InsRβ表達(dá)明顯減少，磷酸化水平下降，提示肝氣郁結(jié)型NAFLD大鼠肝臟存在IR；在高脂飼料誘導(dǎo)下FOXO1A表達(dá)增加，但其磷酸化水平減少，證明肝細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，存在明顯IR。經(jīng)過(guò)柴胡疏肝散治療，肝InsR-β表達(dá)增加，磷酸化水平升高，提示IR緩解；FOXO1A表達(dá)變化不明顯的情況下，磷酸化水平升高，證明細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)改善，IR緩解。上述蛋白表達(dá)與修飾的變化，提示柴胡疏肝散改善肝氣郁結(jié)型NAFLD大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，可能與增加肝InsR-β表達(dá)，提高磷酸化修飾水平，改善肝胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

近年來(lái)，NAFLD的發(fā)病機(jī)制由“二次打擊”學(xué)說(shuō)發(fā)展為“多重打擊”學(xué)說(shuō)，包括脂毒性、線粒體功能失調(diào)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、腸源性?xún)?nèi)毒素等［17-18］。現(xiàn)代分子藥理學(xué)研究表明，柴胡疏肝散調(diào)節(jié)NAFLD肝臟脂質(zhì)代謝紊亂、減輕炎性反應(yīng)，還可能與調(diào)節(jié)IRE-1α／NF-κB、AMPK／SIRT1／p53通路有關(guān)［19-21］。中醫(yī)藥具備有多途徑、多靶點(diǎn)的藥理學(xué)特點(diǎn)，為從多角度綜合防治NAFLD提供可能，值得進(jìn)一步深入的探索。