電針心包經(jīng)穴對MCAO大鼠NR2A、NR2B表達(dá)的影響*

劉蕾，周穎，袁柳媚，馬雁鴻，蔣佳，陳成，潘江，章薇，婁必丹

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長沙 410007

2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南長沙 410007

腦梗死（cerebral infarction）是目前我國成年人的主要致死、致殘病因，是造成人均壽命縮短的重要因素[1]。研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后會(huì)導(dǎo)致一系列的級聯(lián)反應(yīng)，如細(xì)胞膜去極化[2]、細(xì)胞能量與代謝障礙[3]、大量興奮性氨基酸（excitatory aminoacids，EAA）釋放[4]，引起急性腦組織壞死與遲發(fā)的程序性細(xì)胞凋亡，最終形成梗死灶。谷氨酸（glutamic acid，GLU）是興奮性氨基酸中的主要神經(jīng)遞質(zhì)，N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）是谷氨酸離子型通道受體中最重要的一種。而NR2A、NR2B是NMDA受體的重要調(diào)節(jié)亞單位，在腦缺血病程中具有雙向調(diào)節(jié)作用[5-6]，既可以介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路，也可以激活神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)通路。針灸治療缺血性腦卒中一直以來就是中醫(yī)的優(yōu)勢，研究顯示，針灸能促進(jìn)神經(jīng)和血管再生[7]、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[8]等。本研究以MCAO大鼠為受試對象，探討電針對腦缺血后不同時(shí)期NR2A、NR2B表達(dá)的影響。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級健康SD雄性大鼠60只，體重在240～260g，購買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證編號：SYXK（湘）2015-0008。分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度（24±2）℃，相對濕度50%～60%。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置，符合科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

2 主要試劑及儀器

2.1 主要試劑 RIPA細(xì)胞裂解液（C1053，北京普利萊基因技術(shù)有限公司）、BCA蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit，CW0014S，康 為 世 紀(jì)）、PVDF膜（IPVH00010，Millipore）、封閉專用脫脂奶粉（P1622，北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。內(nèi)參一、二抗：Mouse Monoclonal Anti-Actin（TA-09，中 杉 金 橋，1/2000）、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（ZB-2305，中杉金橋，1/5000）。目的抗體：Rabbit Anti NR2A （DF7955，Affinity，1/2000）、Rabbit Anti NR2B （AF6426，Affinity，1/1000）。

2.2 主要儀器 單道可調(diào)移液器（0.5-10ul、20-200ul、100-1000ul，梅特勒 -托利多儀器（上海）有限公司）、冷凍高速離心機(jī)（TGL-16D，常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司）、紫外分光光度計(jì)（UV-1600PC，上海美譜達(dá)儀器有限公司）、蛋白垂直電泳儀（DYY-6C，北京市六一儀器廠）、恒溫?fù)u床（TC-100B，上海領(lǐng)成生物科技有限公司）、超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Chemi DocTM XRS+，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）、SDZ-Ⅱ華佗電針治療儀、華佗牌0.18mm×13mm毫針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

3 動(dòng)物造模及分組

所有大鼠均自由進(jìn)水及飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)3～4d，術(shù)前禁食1d。參照Longa E Z等[9]運(yùn)用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型。腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，鈍性分離左側(cè)胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌間的肌間隙，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），再進(jìn)一步分離CCA、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）、頸外動(dòng)脈（ECA），在CCA分叉部前剪0.2mm小口，然后將栓線（4-0尼龍線）插入，輕推尼龍線尾端經(jīng)CCA分叉部沿ICA入顱，至大腦中動(dòng)脈口，以阻斷大腦中動(dòng)脈（MCA）及顱內(nèi)反流來的血流。

造模成功標(biāo)準(zhǔn)：對造模后自然蘇醒的大鼠進(jìn)行Zea Longa進(jìn)行評分，得分1～3分的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，其余剔除。Zea Longa評分分為5級，0～4分制：0分，無神經(jīng)損傷；1分，提尾時(shí)對側(cè)前肢內(nèi)收屈曲；2分，爬行時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分，站立或爬行時(shí)，向?qū)?cè)傾倒；4分，無自主活動(dòng)伴意識障礙。

將造模成功的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表，完全隨機(jī)分成模型組與電針心包經(jīng)組各30只，再將2組的大鼠二次隨機(jī)分成 1d、3d、7d、14d、21d 的 5 個(gè)亞組，每亞組各6只。

4 干預(yù)處理方式

4.1 電針心包經(jīng)穴組 選穴：根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]動(dòng)物穴位圖譜及擬人比照法確定穴位定位。選取大鼠癱瘓側(cè)肢體心包經(jīng)穴：天泉、曲澤、內(nèi)關(guān)、大陵穴。操作：在造模成功后第2天開始行電針治療，按不同亞組處理方案進(jìn)行干預(yù)，每日1次，每次30min。大鼠捆綁后用0.18mm×13mm毫針刺入大鼠癱瘓側(cè)肢體心包經(jīng)穴位，針刺深度2～4mm。取天泉、曲澤穴1組，內(nèi)關(guān)、大陵穴1組。連接華佗牌電針治療儀，極性固定，近心端接正極，遠(yuǎn)心端接負(fù)極，電針刺激參數(shù)： 連續(xù)波，輸出電壓2～4V，輸出電流3～6mA，頻率20Hz，強(qiáng)度以局部組織輕顫為度。

4.2 模型組 只做捆綁處理，不進(jìn)行電針刺激。每日1次，每次30min，按不同亞組方案進(jìn)行相應(yīng)處理。

5 大鼠神經(jīng)功能缺損評分

每組每只大鼠在造模成功后進(jìn)行一次行為學(xué)評分，在處死取材前再一次進(jìn)行評分。行為學(xué)評分根據(jù)孫敬芳[11]《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》大鼠行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，滿分為11分，分?jǐn)?shù)越高，動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重，用于評價(jià)大鼠腦缺血后運(yùn)動(dòng)功能的損傷及恢復(fù)情況。

6 Western blot檢測NR2A、NR2B的蛋白表達(dá)

進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分后，處死大鼠，取缺血病灶的腦組織。將腦組織放入研缽中充分研磨，加入500ul的細(xì)胞裂解液，裂解細(xì)胞提取蛋白，用紫外分光光度計(jì)測定蛋白濃度。蛋白上樣，將配置好的膠板架子放入到電泳液里拔去齒梳，加入一定體積的蛋白樣品和Marker。開始電泳，60V壓縮蛋白，80V分離蛋白（120min）。當(dāng)條帶跑至膠板一半的時(shí)候配置1×轉(zhuǎn)膜液，并預(yù)冷。切好大小合適含有內(nèi)參或目的條帶的膠。放好海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿，用1×轉(zhuǎn)膜液將海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿浸沒，用300mA恒流轉(zhuǎn)膜2h。用1×TBST配置3%的脫脂牛奶封閉液，室溫封閉1h。配置1抗稀釋液（根據(jù)抗體說明書推薦濃度），將PVDF膜孵育一抗過夜。洗膜，用1×TBST浸泡10 min后棄掉1×TBST，重復(fù)3次。配置2抗稀釋液（根據(jù)抗體說明書推薦濃度，1：2000稀釋），將PVDF膜孵育二抗2h。洗膜，用1×TBST浸泡10 min后棄掉1×TBST，重復(fù)3次。配置發(fā)光液，用發(fā)光液浸濕PVDF膜后放置于超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)樣品放置區(qū)運(yùn)行程序顯影成像。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，運(yùn)用Graph-Pad Prism 8軟件繪圖。計(jì)量資料用（）表示。 符合方差齊性和正態(tài)分布用兩樣本均數(shù)比較的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析組間差異，組間比較選用 LSD檢驗(yàn)。不符合方差分析條件的數(shù)據(jù)，用mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠行為學(xué)評分

大鼠行為學(xué)評分，同一時(shí)相點(diǎn)與處理前比較，模型組僅21d亞組處理后評分降低（P＜0.05），即模型組大鼠的行為障礙在21d時(shí)有所減輕；電針心包經(jīng)組3d、7d、14d、21d 亞組處理后評分明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），即電針經(jīng)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能在第3天就開始逐步改善。見表1，圖1。

2 各組大鼠的NR2A蛋白表達(dá)

大鼠的NR2A蛋白表達(dá)，同1時(shí)相點(diǎn)與模型組相比，電針心包經(jīng)組各亞組差異均具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05，P＜0.01）。電針心包經(jīng)組大鼠的NR2A蛋白表達(dá)在 1d、3d、7d低于模型組，在 14d、21d時(shí)高于模型組。見表2，圖2。

3 各組大鼠的NR2B蛋白表達(dá)

大鼠的NR2B蛋白表達(dá)，同1時(shí)相點(diǎn)與模型組相比，電針心包經(jīng)組各亞組差異均具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.01）。電針心包經(jīng)組大鼠的NR2B蛋白表達(dá)在1d、3d、7d低于模型組，在 14d、21d時(shí)高于模型組。見表 3，圖 3。

表1 MCAO大鼠行為學(xué)評分 （）

表1 MCAO大鼠行為學(xué)評分 （）

注：同一時(shí)相點(diǎn)，與處理前比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

時(shí)間 例數(shù) 模型組心包經(jīng)穴組處理前 處理后 處理前 處理后1d 12 7.000±0.365 7.833±0.307 7.333±0.333 7.500±0.224 3d 12 7.000±0.258 7.500±0.224 7.333±0.558 5.667±0.211△7d 12 7.167±0.307 7.833±0.478 7.167±0.477 5.000±0.258△△14d 12 7.167±0.167 7.000±0.258 7.000±0.578 4.333±0.333△△21d 12 7.333±0.615 5.833±0.167△ 7.167±0.654 3.833±0.307△△

圖1 MCAO大鼠同1時(shí)相點(diǎn)行為學(xué)評分比較

表2 MCAO大鼠的NR2A蛋白表達(dá)

圖2 MCAO大鼠NR2A蛋白表達(dá)比較

討 論

NMDA是谷氨酸離子通道型受體中重要的一種，而NR2A、NR2B是NMDA受體的主要調(diào)節(jié)亞基，調(diào)節(jié)NMDA受體離子通道動(dòng)力學(xué)特性、激動(dòng)劑親和性以及對通道阻滯劑的敏感性，故不同NMDA受體亞型及不同的刺激方式，使NMDA受體具有不同的生物物理和生物化學(xué)特性。在腦缺血病程中，激活的NMDA受體，一方面可介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，造成Ca2+超載，引發(fā)一系列損傷級聯(lián)反應(yīng)；另一方面NMDA受體可以激活促進(jìn)生存的信號通路，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受缺血缺氧造成的損傷。大量研究表明，NMDA受體在腦缺血病程中具有的雙向作用，與NR2A、NR2B的調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。

表3 MCAO大鼠的NR2B蛋白表達(dá)

圖3 MCAO大鼠NR2B蛋白表達(dá)比較

在對NR2A、NR2B的研究中，有的學(xué)者認(rèn)為NR2A主要參與缺血再灌注大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖過程[12]，而在腦梗死狀態(tài)下，NR2B表達(dá)量的增加與神經(jīng)元損傷有著密切聯(lián)系[13]。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在腦缺血中NR2A表達(dá)上升時(shí)，腦梗死面積增加[14]，而通過一些藥物降低NR2A的表達(dá)，有助于減少腦梗死中的神經(jīng)損傷[15]，而NR2B在神經(jīng)細(xì)胞的凋亡模型中發(fā)揮著明顯的保護(hù)作用[16]。且缺血性腦梗死的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)、復(fù)雜而有序的過程，而NR2A、NR2B在病程的不同時(shí)期發(fā)揮的功能還未確定，其有可能在各時(shí)間段發(fā)揮著不同的作用。

研究表明，在腦缺血的早期，大量的GLU釋放到細(xì)胞外，腦脊液中谷氨酸（Glu）在發(fā)病24 h內(nèi)即可明顯升高，而這種升高狀態(tài)可持續(xù)1周[17]。因此，細(xì)胞外大量的GLU通過激活NMDA受體，介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，造成Ca2+超載，引發(fā)一系列損傷級聯(lián)反應(yīng)。而Glu引起的Ca2+內(nèi)流分為兩個(gè)階段，第一個(gè)階段為快速的初始內(nèi)流，第二階段為延遲的更大內(nèi)流。前者主要是由NR2A型受體介導(dǎo)，后者主要是激活含有NR2B的NMDA受體[18-19]。被激活的NR2A型受體依賴Ca2+超載，激活促凋亡信號通路。而NR2B型受體可以激活多種下游信號通路促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，例如DAPK1[20]、CDK5[21]等。

并且在這個(gè)時(shí)期，NR2A、NR2B處于高表達(dá)狀態(tài)，而通過降低NR2A、NR2B表達(dá)，可以有效提高缺血耐受性，降低神經(jīng)功能缺損評分、縮小腦梗死容積，保護(hù)受損的神經(jīng)元[22-23]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，電針心包經(jīng)組NR2A、NR2B蛋白表達(dá)，在第1天、第3天、第7天均低于模型組（P＜0.05）。且電針心包經(jīng)組MCAO大鼠的行為障礙，在第3天開始得到改善。表明在腦缺血后1～7d，電針通過降低NR2A、NR2B蛋白表達(dá)，有利于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，提高缺血耐受性，改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能。

在腦缺血的后期，細(xì)胞外的GLU濃度逐漸下降，大腦進(jìn)入自身修復(fù)狀態(tài)。此時(shí)，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞被激活發(fā)育成熟并替補(bǔ)受損神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在9～13d為增殖高峰，28d后分化為成熟神經(jīng)元[24]，而NR2A、NR2B在神經(jīng)元樹突分支的發(fā)育與成熟中發(fā)揮著重要作用，參與了突觸可塑性、記憶認(rèn)知功能的形成，從而介導(dǎo)著神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育過程[25-26]。有研究顯示，在這個(gè)時(shí)期，NR2A、NR2B處于一個(gè)低表達(dá)水平，通過促進(jìn)NR2A、NR2B的表達(dá)，有利于恢復(fù)受損的神經(jīng)功能網(wǎng)絡(luò)[27-28]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，腦缺血后的第14天、第21天，模型組的NR2A、NR2B蛋白表達(dá)處于較低水平，電針心包經(jīng)組NR2A、NR2B的表達(dá)水平顯著升高，且在14d時(shí)已經(jīng)超過模型組，第21天時(shí)電針心包經(jīng)組NR2A、NR2B的平均蛋白含量分別是模型組的3.5倍、5.5倍。且電針心包經(jīng)組行為學(xué)評分隨治療時(shí)間逐漸降低，提示大鼠的行為障礙減輕，運(yùn)動(dòng)功能逐步恢復(fù)。

綜上，電針心包經(jīng)在腦缺血的早期，可抑制NR2A、NR2B的表達(dá)，增加缺血耐受性，保護(hù)受損的神經(jīng)細(xì)胞；而在腦缺血后期，通過促進(jìn)NR2A、NR2B的表達(dá)，激活神經(jīng)細(xì)胞存活通路，修復(fù)受損的神經(jīng)細(xì)胞。