普通培養基與優化培養基對防城港海域真菌分離效果的影響*

劉思遠，王巧貞，吳鴻仙，黃庶識，馮 潔**

(1.廣西醫科大學藥學院，廣西南寧 530021；2.廣西科學院，廣西生物物理與環境科學研究中心，廣西南寧 530007)

0 引言

海洋真菌是海洋微生物的一個重要分支[1]，它們常以寄生或腐生的方式，在海洋或港灣生態環境中生長[2，3]，并且參與有機物的分解和無機營養物的再生過程，是維持海洋生態系統二氧化碳產生與固定之間動態平衡的關鍵[4]。同時，由海浪與河流黏土沉積形成的港灣泥灘，是一種與沙灘不同的獨特環境[5]，海洋微生物為了適應其特殊環境，往往發展出獨特的生命代謝途徑，由此能夠產生結構特異、生物活性特殊的次生代謝產物[6，7]。因此，分離、純化和鑒定海洋微生物，對于揭示當地海域微生物種類，保存菌種，建立樣品庫，提供研究海洋微生物藥物和農藥的有效菌種[8]，以及進一步研究其次生代謝產物及其生理活性等均有重要意義。目前，已有文獻報道常見真菌培養基的配方[9]，北部灣海域也發現多種具有生物活性的海洋真菌[10-12]，然而針對不同分離培養基及加入不同抑制劑的優化培養基對海洋真菌分離效果及分離多樣性的系統研究報道較為少見。本文采用不同培養基對采自廣西防城港的海泥樣品進行研究，運用相對多度(Relative Abundance)、Simpson指數、Jaccard系數考察不同培養基在提取、分離、純化菌種時的效果，在達到高效分離純化菌種目標的同時，又可以自主選擇分離樣品的多樣性與特異性，供同仁們參考；此外，分離得到的菌種還可以為后續海洋微生物的應用研究及次生代謝產物研究提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 海泥樣品

2017年12月23日，于防城港市(21°36′57″N，108°13′47″E)采集海泥樣品，采樣深度為海灘地面下15 cm處，將海泥樣品置于采樣袋中，用冰盒轉運至廣西科學院生物物理與環境科學研究中心，于4℃冰箱中暫存備用。

1.2 普通培養基與優化培養基

6種普通培養基(定容1 L)分別是MD普通培養基(葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，瓊脂20 g，無菌海水50%)、PDA普通培養基(煮沸去除濾液的馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂14 g，無菌海水50%)、YPDA普通培養基(蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，葡萄糖2 g，0.2%腺嘌呤溶液15 mL，瓊脂20 g，無菌海水50%)、CA普通培養基(硝酸鈉3 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，無菌海水50%)、SA普通培養基(麥芽糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，無菌海水50%)及PA普通培養基(蛋白胨2 g，七水合硫酸鎂0.5 g，瓊脂20 g，無菌海水50%)。各培養基使用去離子水配制，封口后在120℃下高溫滅菌30 min，冷卻至50℃時加入慶大霉素，使之濃度為50 μg/mL，以抑制細菌生長。

優化培養基以MD和PDA作為基礎培養基。8種抑制劑如下：青霉素20 μg/mL、鏈霉素50 μg/mL、氯霉素0.1 mg/mL、孟加拉紅1 mg/3 mL、青霉素20 μg/mL+慶大霉素50 μg/mL、鏈霉素50 μg/mL+慶大霉素50 μg/mL、青霉素20 μg/mL+氯霉素0.1 mg/mL、鏈霉素50 μg/mL+氯霉素0.1 mg/mL；后4種復合抑制劑以下簡稱為青+慶、鏈+慶、青+氯、鏈+氯。

1.3 儀器與設備

滅菌的離心管及移液器槍頭，各量程的移液器。

SW-CJ-1F潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)、LHS-250SC恒溫恒濕箱(上海天呈實驗儀器制造有限公司)、1-1SP小型臺式離心機(德國SIGMA公司)、070-851型熱循環儀(德國Biometra公司)、美國伯樂電泳儀系統、Omega Fluor凝膠成像儀(美國Aplegen公司)。

10%的chelex-100樹脂(購自上海伯樂生命醫學產品有限公司)；膠紅(購自BIOTIUM公司)；引物ITS1、引物ITS4、5×loading buffer(購自上海捷瑞生物工程有限公司)；Taq PCR Master Mix酶、ddH2O(購自生工生物工程上海股份有限公司)；Trans 15K DNA Marker(購自北京全式金生物技術有限公司)。

1.4 真菌分離

稱取2 g海泥置于裝有8 mL無菌水溶液的滅菌離心管中，震蕩后取上層懸濁液，用無菌水將其梯度稀釋1 000倍，分別取100 μL涂布于各培養基上，每種培養基重復3次，每天觀察并記錄真菌生長情況，通過菌落形態、顏色、大小來確定真菌種類，并編號留樣。

1.5 真菌純化

將所得各菌種接種于相同的培養基上反復純化，直至得到外觀、形態、顏色上一致的無雜菌污染的純種菌種。采用50%甘油水溶液置于-80℃冰箱中長期保存，采用內裝有斜面固體培養基的試管置于4℃冰箱短期保存。

1.6 真菌DNA提取

在超凈工作臺上，挑取純化得到的真菌菌落，按試劑盒操作指南或按傳統提取DNA的方法進行操作。試劑盒為Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。傳統方法即將菌落挑取至1.5 mL離心管中，倒入液氮研磨成粉末狀；再加入10%的chelex-100樹脂50 μL，水浴100℃加熱10 min，冷卻至室溫(25℃以下)后，12 000 r/min離心10 min，保留上清液，即含真菌DNA。

1.7 PCR擴增

取1 μL 1.6節的上清液與12 μL Taq酶、0.5 μL ITS4引物、0.5 μL ITS1引物、11 μL ddH2O混合進行PCR擴增。PCR反應程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1.5 min，34個循環后72℃充分延伸10 min。正向ITS1引物序列為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，反向ITS4引物序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.8 瓊脂糖凝膠電泳檢測

取1 μL擴增產物與DNA Marker進行凝膠電泳，條件為電壓110 V，電流400 mA，電泳時間30 min。隨后在Omega Fluor 凝膠成像儀下觀察熒光條帶以辨別DNA是否提取成功，后將提取成功的DNA樣品送至生工生物工程上海股份有限公司進行DNA測序。

1.9 種屬鑒定

將測得的DNA序列用Contig Express軟件拼接并在NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov)進行BLAST比對，以序列相似度大于或等于97%確定其屬(Genus)的分類學依據。

1.10 數據分析

本研究采用SPSS 17.0軟件(Chicago,IL,USA)進行統計學分析，統計檢驗為卡方檢驗(X2)，以α=0.05作為檢驗水準。

本研究采用Simpson 指數和Jaccard系數分析菌種多樣性。Simpson指數是描述生境內物種多樣性的指標之一，數值越大說明生境內真菌的均衡性和豐富程度越高；Jaccard系數是比較兩個集合間相似性與差異性的指標，數值越小說明兩集合的差異越大[13]。

2 結果與分析

2.1 防城港海域海泥真菌組成

選取序列相似度≥97%的菌株，并將其中相似度等于100%的菌株去除，最終共得111株不同的菌株。其中有1株葫蘆霉科Cucurbitariaceae真菌、3株子囊菌門Ascomycota真菌因未確定種屬均不納入本次分析比較。以屬作為分析的基本單位共分析107株真菌，不同屬的真菌在防城港海域海泥中的構成差異明顯，其中優勢菌種依次為青霉屬Penicillium39株，相對豐度36.45%；其次為枝孢屬Cladosporium21株，相對豐度19.63%；然后是曲霉屬Aspergillus11株，相對豐度10.28%。擲孢酵母屬Sporobolomyces、籃狀菌屬Talaromyces、Papiliotrema屬各4株，相對豐度均為3.74%；棒孢酵母屬Clavispora和囊擔菌屬Cystobasidium各3株，相對豐度均為2.80%；柄銹菌屬Puccinia、紅酵母屬Rhodotorula和Krasilnikovozyma屬各2株，相對豐度均為1.87%；附球菌屬Epicoccum、擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis、假絲酵母屬Candida、莖點霉屬Phoma、擬青霉屬Purpureocillium、球腔菌屬Mycosphaerella、鐮刀菌屬Fusarium、孔韌菌屬Porostereum、Acrodontium屬、Geosmithia屬、Pezizomycotina屬和Roussoella屬各1株，相對豐度均為0.93%。

2.2 普通培養基的分離結果

6種普通培養基的分離結果如表1所示，PA普通培養基分離種類最少，為4屬；SA普通培養基中分離出的真菌種類最多，為10屬；其余4種普通培養基分離效果之間沒有顯著差異(P>0.05)。對比酵母菌和霉菌的分離效果，6種普通培養基分離得到的酵母菌最少為3屬，最多為4屬，分離效果相近；而在霉菌的分離效果上，SA普通培養基分離出霉菌最多為7屬，PA、CA普通培養基只分離出1屬，其余3種普通培養基分離的霉菌屬數相近，無顯著差異(P>0.05)。

表1 從6種普通培養基中分離得到的真菌屬數Table 1 Number of fungal genera isolated from six common media

6種普通培養基所分離出的真菌種數如表2所示。雖然PA普通培養基分離出的真菌屬數較少，但是從中分離得到的囊擔菌屬Cystobasidium真菌為41株，相比于其他的普通培養基具有顯著優勢(P<0.05)。YPDA普通培養基對枝孢屬Cladosporium真菌的分離效果較其他普通培養基具有顯著優勢(P<0.05)。此外，柄銹菌屬Puccinia真菌只在PA、CA普通培養基分離得到，擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis真菌也只在SA、PDA普通培養基中分離得到。籃狀菌屬Talaromyces、球腔菌屬Mycosphaerella及Geosmithia屬真菌只在SA培養基中分離得到，Porostereum屬真菌只在YPDA普通培養基分離得到，莖點霉屬Phoma、Papiliotrema屬真菌只在PDA普通培養基中分離得到，假絲酵母屬Candida、Acrodontium屬及Roussoella屬真菌只在MD普通培養基中分離得到。說明普通培養基對這些屬真菌分離的選擇性較高。綜上，PDA、MD和YPDA得到的酵母數和霉菌數比較均衡，結合實際應用考慮，采用PDA、MD培養基進行下一步實驗。

表2 從6種普通培養基分離得到的真菌種數Table 2 Number of fungi species isolated from the six common media

2.3 含不同抑制劑的優化培養基的分離結果

為了進一步探討不同抑制劑對海洋真菌生長的影響，本研究利用含有不同抑制劑的PDA、MD優化培養基進行分離實驗。從分離結果可以看出(表3)，PDA優化培養基共分離得到244株霉菌，MD優化培養基共分離得到141株，株數上PDA優化培養基的分離效果明顯優于MD優化培養基(P<0.05)；從屬數來看，PDA優化培養基共分離得到4屬霉菌，而MD優化培養基共分離得到8屬霉菌。在PDA優化培養基中，分離霉菌株數最多的前4位依次為含鏈霉素的優化培養基(63株)>含鏈+慶的優化培養基(57株)>含鏈+氯的優化培養基(46株)>含氯霉素的優化培養基(41株)。在MD優化培養基中，分離菌株數量最多的前3位依次為含鏈+慶的優化培養基(44株)>含鏈+氯的優化培養基(38株)>含氯霉素的優化培養基(21株)。含鏈霉素、氯霉素的PDA優化培養基分離效果顯著優于分別含這兩種抑制劑的MD優化培養基(P<0.05)。PDA、MD優化培養基均分離得到3屬酵母菌，與2.2節的結果基本一致。

表3 優化培養基的分離結果Table 3 Separation results of optimized medium

含不同抑制劑的優化培養基分離得到的真菌種類如表4所示。其中分別含鏈霉素、氯霉素、鏈+慶、鏈+氯的PDA優化培養基及分別含鏈+慶、鏈+氯的MD優化培養基分離得到的真菌株數較多，這6種優化培養基的分離效果明顯優于其他10種優化培養基(P<0.05)。青霉屬Penicillium因為適應力較強，所有優化培養基均可分離得到；其次為枝孢菌屬Cladosporium及曲霉屬Aspergillus，含孟加拉紅的MD優化培養基對分離枝孢菌屬稍有優勢，含孟加拉紅的PDA優化培養基對分離曲霉屬稍有優勢。另外，含青+氯的MD優化培養基對分離籃狀菌屬Talaromyces具有顯著優勢(P<0.05)；囊擔菌屬Cystobasidium、擬青霉屬Purpureocillium、柄銹菌屬Puccinia以及Krasilnikovozyma屬只在含青霉素的MD優化培養基中分離得到；鐮刀菌屬Fusarium真菌只在含青+慶的MD優化培養基中分離得到；棒孢酵母屬Clavispora僅在含鏈+慶的PDA優化培養基中分離得到；擲孢酵母屬Sporobolomyces僅在含青+氯的PDA優化培養基中分離得到。

表4 優化培養基所分離得到的真菌屬及種數Table 4 The genera and species number of fungi isolated from optimized medium

2.4 多樣性分析

從表5中可以看出，SA、MD普通培養基具有良好的均衡性與多樣性(Simpson指數>0.8)，PA普通培養基的Simpson指數明顯低于其他5種普通培養基，原因是PA普通培養基對真菌的選擇性較高。在含不同抑制劑的優化培養基中，含青霉素、孟加拉紅的PDA優化培養基以及含青霉素、青+慶、青+氯的MD優化培養基均衡性較好(Simpson指數70.6)，多樣性與豐富性也較高；含氯霉素、鏈霉素、鏈+慶、鏈+氯的PDA優化培養基與含鏈霉素、鏈+慶、鏈+氯的MD優化培養基Simpson 指數偏低(<0.2)，說明這些優化培養基具有明顯的選擇性，適用于培養與分離特定種屬的真菌。

表5 普通培養基及優化培養基的Simpson指數Table 5 Simpson index of common medium and optimized medium

另外，雖然MD、PDA普通培養基具有良好的均衡性和多樣性，但是在加入抑制劑后，其Simpson指數均有不同程度的降低。其中，分別含青霉素、孟加拉紅的PDA優化培養基及分別含青霉素、青+慶、青+氯的MD優化培養基，Simpson指數與其普通培養基相近，但分別含鏈霉素、氯霉素、鏈+慶、鏈+氯的PDA優化培養基，及分別含鏈霉素、鏈+慶、鏈+氯的MD優化培養基Simpson指數降幅較大，顯示出與普通培養基截然不同的選擇性。

從表6-表8可以看出，普通培養基的Jaccard系數為0.222-0.600，說明它們的分離效果相似度較低，集合內異質性較高。而優化培養基的Jaccard系數為0.111-1.000，范圍跨度較大。其中，含孟加拉紅的MD優化培養基與含鏈+氯的MD優化培養基之間Jaccard系數為1.000，說明這兩種培養基的分離差異性極小。但對比表5可知，二者Simpson指數差異較大，含鏈+氯的MD優化培養基對青霉屬真菌的選擇性遠高于含孟加拉的MD優化培養基。

表6 普通培養基的JaccardTable 6 Jaccard index of common medium

表7 PDA優化培養基的Jaccard系數Table 7 Jaccard index of optimized PDA medium

表8 MD優化培養基的Jaccard系數Table 8 Jaccard index of optimized MD medium

3 討論

目前國內關于不同培養基和不同抑制劑對海洋微生物分離效果的研究報道尚少，不同培養基由于成分不同，對真菌分離效果的均衡性與選擇性具有一定差異。目前學界普遍認為，抗生素作為抑制劑可抑制細菌生長，對真菌生長及分離一般沒有顯著影響。但是本研究發現，加入不同抑制劑的培養基之間及其與原培養基之間，對同一份樣品的真菌分離效果相差甚遠，說明選擇合理的抑制劑有助于快速分離目標海洋真菌。

本研究所得優勢菌屬與多地已有報道的海洋真菌構成相似[14]。6種普通培養基中，SA培養基分離得到的菌株種數最多，PA普通培養基所得菌株最少，Simpson指數分析結果與這一情況相符。PA普通培養基和YPDA普通培養基對菌株的分離效果表現出明顯的選擇性，其余4種普通培養基的Simpson指數較為接近；其中，MD普通培養基多樣性與均衡性較高，與文獻[12]結果相似。但在優化培養基的實驗中發現，含抑制劑的MD優化培養基Simpson指數均有所下降且程度不一，說明抑制劑在抑制細菌生長的同時可能也會對真菌的生長產生一定的抑制作用，但目前并沒有明確研究表明其影響機制、程度及范圍。其中，分別含青霉素、青+慶的MD優化培養基的均衡性相對較高，與MD普通培養基的Simpson指數較為接近。其余優化培養基的Simpson指數均小于0.7，而且分別含鏈霉素、氯霉素、鏈+氯的PDA優化培養基與分別含鏈霉素、鏈+慶、鏈+氯的MD優化培養基的Simpson指數小于0.1，結合表4可知這5種優化培養基在分離海洋真菌時對青霉屬Penicillium具有較高的選擇性。

6種普通培養基之間的Jaccard系數均不超過0.6，說明任意兩種普通培養基分離所得的菌種組成相似度都較低。在優化培養基中，MD優化培養基分離的菌屬數稍多于PDA優化培養基，但從PDA優化培養基中分離得到的菌株數量明顯多于MD優化培養基，產生該數量差異的主要原因是PDA培養基對青霉屬真菌具有較高的選擇性，這與文獻[9]的報道一致。但是PDA培養基的這種選擇性在6種普通培養基的實驗中并沒有充分表現，而是表現出對囊擔菌屬Cystobasidium的高選擇性，故推測優化培養基中的8種抑制劑均可能對青霉屬真菌有抑制作用。優化培養基之間的Jaccard系數數值跨度均較大。其中值得注意的是，含孟加拉紅的MD優化培養基與鏈+氯的優化MD培養基之間的Jaccard系數為1.000，是由于這兩種培養基所得真菌都為青霉屬Penicillium和枝孢菌屬Cladosporium真菌。結合Simpson指數可以看出，含孟加拉紅的MD優化培養基對這兩種真菌的分離具有較好的均衡性，而含鏈+氯的MD優化培養基對青霉屬Penicillium真菌具有較高的選擇性。

本研究中除分離得到111株基因序列相似度≥97%的真菌外，還發現了9個基因序列相似度小于97%的真菌菌株，其中5個菌株相似度小于94%。通常相似度94%被認為是區分一個新種的最低界限，而相似度96.4%被認為是值得區分一個新屬的界限[15]，因此小于97%則無法確定這些真菌的種屬，未被列入本文研究對象。這9個相似度小于97%的菌株將會在后續研究中根據形態特征和系統發育樹確定其歸類。

本研究分離得到青霉屬真菌7種，包括托姆青霉Penicilliumthomii、橘青霉P.citrinum、草酸青霉P.oxalicum、爪哇青霉P.javanicum、產紫青霉P.purpurogenum、簡青霉P.simplicissimum、菌核青霉P.sclerotiorum；枝孢菌屬真菌7種，包括黃色枝孢菌Cladosporiumxanthochromaticum、狹枝孢菌C.tenuissimum、芽枝狀枝孢菌C.cladosporioides、澳洲枝孢菌C.australiense、尖孢枝孢菌C.oxysporum、C.Perangustum、C.anthropophilum等，這兩屬真菌具有廣泛的藥用前景，包括抗癌[16,17]、抗菌[18]、抗氧化[19]以及合成藥用活性化合物的關鍵前體[20,21]。本研究結果有助于建立北部灣海域真菌樣品庫，為后續海洋真菌代謝產物分離、結構鑒定及生物活性提供基礎資料，同時也為高效地提取分離海洋真菌提供有價值的參考。