球形棕囊藻增加水體黏度對柱形寬水蚤的攝食抑制*

李 杰，陸家昌**，藍彩碧，賴俊翔，王佳樂，韋福佳

(1.廣西科學院，廣西北部灣海洋研究中心，廣西近海海洋環境重點實驗室，廣西南寧 530007；2.廣西大學海洋學院，廣西南寧 530006)

0 引言

球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa，下文簡稱棕囊藻)是在熱帶、亞熱帶和溫帶海域廣泛分布的浮游植物赤潮種，對海洋生物化學循環、氣候調節以及漁業安全有重要影響[1-3]。棕囊藻具有異常復雜的單細胞-囊體相互轉變的生活史，多以囊體形態形成赤潮[4]。目前的研究普遍認為，棕囊藻由單細胞過渡到囊體結構屬于一種防御性的生存策略，膠狀的囊體結構不僅可以抵御細菌或病毒的侵害，還可以通過增大自身的粒級來抑制捕食者攝食[5,6]。棕囊藻的囊體結構是一層厚度大約為7 μm的膠狀透明外被，主要成分為多糖[7,8]。在棕囊藻形成囊體過程中，細胞會隨著高分子化合物的對外分泌，提高周圍水體環境的黏度[9]。有研究報道，在棕囊藻赤潮暴發前期，水體中葉綠素a濃度與水體黏度有正相關關系[10]。不僅如此，透明胞外顆粒聚合物(Transparent Exopolymer Particles,TEP)也與葉綠素a濃度有正相關關系[11]。但在赤潮衰敗期，水體黏度、TEP含量則與葉綠素a濃度呈負相關的關系，這說明細胞分泌物對水體黏度變化起到主要的驅動作用[10]。

近年來，有研究提出棕囊藻細胞分泌溶解有機物(Dissolved Organic Carbon，DOC)形成TEP屬于抵御捕食者的生存策略[12]。但對于其內在機制仍然存在爭議，比如海洋初級生產力的主要消費者橈足類，有研究認為棕囊藻帶來的水體黏度增加不足以抑制橈足類的攝食。橈足類在棕囊藻赤潮期間所表現出來的腸道內含物低，或者對某一浮游植物的攝食率下降與水體黏度沒有直接的聯系，而是因為橈足類通過攝食TEP補充食物來源，才導致對浮游植物的攝食率下降，所以橈足類的腸道內含物也隨之下降[13,14]。但也有研究指出浮游植物所分泌高分子化合物引起的水體黏度增加的確會影響橈足類移動，并抑制其攝食行為[15]。Laurent和Vincent[16]的研究指出，棕囊藻所造成的水體黏度的增加使得橈足類長角寬水蚤(Temoralongicornis)的移動速率下降，導致其移動軌跡發生改變，但并不認為橈足類的攝食被抑制。總的來說，關于棕囊藻帶來的水體黏度增加是否會抑制橈足類攝食仍然存在爭議。

本研究利用棕囊藻培養液和海藻酸鈉溶液設置不同水體黏度進行柱形寬水蚤(Temorastylifera)攝食實驗，在此基礎上研究棕囊藻培養液和海藻酸鈉溶液帶來的水體黏度變化對橈足類攝食浮游植物的影響，以期進一步了解棕囊藻赤潮期間橈足類的攝食行為，認識棕囊藻赤潮的發生對浮游生物能量物質循環的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 微藻

牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)從廣西北部灣海洋研究中心獲取，球形棕囊藻于2018年從廣西近岸海域采集分離獲得，保存在廣西北部灣海洋研究中心藻種庫。在恒溫室內以f/2 (-Si)培養液持續傳代培養，培養液的配制參考Guillard[17]的文獻，培養溫度為20℃，鹽度為30，光照強度為2 000 lx，光暗時間比為12 h∶12 h。

1.1.2 柱形寬水蚤

橈足類柱形寬水蚤于2019年采集分離自廣西近岸海域，在廣西北部灣海洋研究中心生態環境實驗室傳代培養，放置于20 L塑料桶內，鹽度為30，室內常溫培養。每天投喂一次球等鞭金藻，食物量約為1 000 μg C/L。每星期投喂一次牟氏角毛藻。每隔兩個星期換掉容器內一半的水，除去柱形寬水蚤的糞便以及多余的食物，保證水質優良。

1.2 方法

1.2.1 棕囊藻單細胞豐度、囊體豐度、囊體直徑的測定

采集處于指數生長期末期的棕囊藻培養液(含囊體結構)，在自然重力的條件下過孔徑為10 μm的篩絹以除去囊體結構。將過濾所獲得的僅含有單細胞的濾液接種到新的f/2 (-Si)培養液中，f/2 (-Si)培養液的體積為2 L(3 L的錐形培養瓶)，接種密度為2 000 cells/mL，設置3個平行培養瓶。培養實驗開始后，每隔兩天在每個培養瓶中采集2 mL的水樣，用魯哥試劑固定(終濃度為5%)，使用浮游植物計數框在倒置顯微鏡(Nikon)下對游離球形棕囊藻進行單細胞計數；實驗開始后的第4天起，每隔兩天采集5-10 mL 的水樣在倒置顯微鏡下檢查囊體的數量和直徑。

1.2.2 黏度測定

黏度測定使用旋轉流變儀(賽默飛，HAAKE MARS 60)，選擇槳葉轉子FLB26系統，剪切掃描模式[18]。測定棕囊藻培養液和海藻酸鈉溶液的黏度值時，測試溫度設置為20℃，轉子的剪切速率為10 r/s，剪切測試時間為30 s。棕囊藻培養實驗開始后，每隔兩天采集30 mL的培養液水樣測定其黏度值。然后直接轉移至旋轉流變儀特定的容器中，參照經孔徑為0.2 μm濾膜過濾的海水(鹽度為30)，測定棕囊藻培養液和海藻酸鈉溶液的黏度值[10]。

1.2.3 TEP含量的測定

培養實驗開始后，每隔兩天采集10-50 mL的水樣用于TEP含量的測定，方法參照Mari等[19]的研究。在低于150 mm Hg的壓力下將水樣過濾到孔徑為0.4 μm的聚碳酸酯膜(Millipore，ATTP，Ireland)上，加入0.5 mL阿利新藍染色劑(Sigma，Switzerland，終含量為0.02%)，對濾膜進行染色，染色時間t<2 s。把膜轉移到15 mL 的樣品管中，加入5 mL濃度為80%的硫酸溶液，浸泡2 h。期間，每隔30 min輕輕搖試管，使TEP充分酸化。使用紫外光分光光度計在787 nm處以1 cm的比色皿測定上清液的吸光值，用蒸餾水做對比參考。TEP的濃度(Ctep)以黃原膠(麥克林，上海)的當量(Gum xanthan equivalent)來表示(μg/liter)，TEP的濃度單位為 (μg/liter xanthan equiv.)。

式中，E787為樣品的吸光值；C787為空白的吸光值；Vf為過濾體積，單位為L；fx為校正因子。

校正因子fx測定和計算方法如下：將15 mg黃原膠混合到150 mL蒸餾水中，以組織研磨器對標準的黃原膠混合溶液進行研磨混合30 min，研磨兩次。取3 mL整數倍的黃原膠標準溶液過濾到預先稱量好重量的濾膜上，干燥濾膜后稱量濾膜上黃原膠的干重(Dry weights)。取等體積的黃原膠標準溶液過濾到濾膜上，使用愛爾新藍染色液對其進行染色處理，操作方法按照上述步驟進行(測定其特定波長處的吸光值)。

fx校正因子的計算參照如下公式：

fx=W×[(Est787-C787)×Vst-1]-1，

式中，W為濾膜上黃原膠的干重(μg/liter)；Est787為黃原膠的吸光值；C787為空白的吸光值；Vst為用于染色的黃原膠標準溶液的體積。

1.2.4 攝食實驗

用孔徑為1 mm 的篩網將柱形寬水蚤的雌體從培養瓶中分離出來，在溫度為20℃，光照強度為2 000 lx的環境條件下，饑餓處理24 h，清空腸胃。將饑餓處理后的柱形寬水蚤轉移至500 mL的三角瓶內，內含由300 mL的棕囊藻培養液或海藻酸鈉溶液，鹽度為30。以過濾自然海水和高密度棕囊藻培養液的黏度作為參考，設置高、中、低3個層次的黏度環境，共計3組攝食實驗，每組3個平行，每個實驗瓶內放置5個柱形寬水蚤實驗個體，實驗時長為24 h。瓶內初始食物濃度為(851.04±80.95) μg C/L。實驗溫度為20℃，光照為2 000 lx。攝食實驗開始前和結束時，每個實驗瓶內取1-2 mL的海水，利用浮游植物計數框(登訊，廈門)在倒置顯微鏡(Nikon)下計算浮游植物的單細胞豐度，通過瓶內餌料食物濃度的變化來計算柱形寬水蚤的攝食率，計算公式參考Frost[20]的文獻。各組實驗的細節見表1。

海藻酸鈉攝食實驗：稱取0.1 g的海藻酸鈉(成都科隆，分析純)加熱攪拌溶解在100 mL純水中，配制成海藻酸鈉母液，再將溶解后的海藻酸鈉母液加入過濾海水中(鹽度為30)，在旋轉流變儀(見1.2.2節)的幫助下調配出與棕囊藻培養液相同的黏度值。共設置3組攝食實驗，每組3個平行，微藻食物為牟氏角毛藻C.muelleri，其他實驗條件與棕囊藻的藻液攝食實驗一致，具體信息見表1。

表1 棕囊藻培養液和海藻酸鈉溶液的黏度攝食實驗信息Table 1 Viscosity ingestion experiment information of P.globosa culture medium and sodium alginate solution

1.2.5 數據處理

通過One-Way Anova分析組間攝食率是否存在顯著性差異，顯著水平設定為P<0.05。棕囊藻的游離細胞豐度、囊體豐度、囊體直徑與培養液的TEP含量、水體黏度之間的數據相關性分析采用Person相關分析( SPSS 20.0,IBM)。

2 結果與分析

2.1 棕囊藻的囊體和游離單細胞

棕囊藻單細胞的豐度隨著生長不斷升高，培養實驗開始后的第4天起開始出現囊體結構，囊體的直徑和囊體的豐度同樣隨著生長而逐漸增大(圖1)。

圖1 棕囊藻游離單細胞豐度(a)、囊體豐度(b)以及囊體直徑(c)生長曲線Fig.1 Growth curve of abundance of solitary cell (a),colony abundance (b) and colony diameter (c) of P.globosa

2.2 TEP和水體黏度

由圖2可知，棕囊藻培養液中的TEP含量以及水體黏度在棕囊藻生長過程中逐漸提高，整體保持持續上升的趨勢。TEP的含量最高值出現在第16天，達到(677.33±34.92) μg/liter xanthan equiv.，黏度為(2.96±0.58)-(4.92±0.19) MPa·s。

圖2 棕囊藻培養液的TEP含量(a)和水體黏度(b)變化

2.3 相關性分析

由表2可以看出，棕囊藻的游離單細胞豐度、囊體豐度以及囊體直徑與TEP的含量、水體黏度均有顯著的正相關關系(P<0.01)。

表2 棕囊藻的游離單細胞豐度、囊體豐度、囊體直徑與TEP含量、水體黏度的相關性分析Table 2 Correlation analysis of P.globosa solitary cell abundance,colony abundance and colony diameter with TEP content and viscosity

2.4 柱形寬水蚤的攝食率

如圖3所示，在棕囊藻濃度高的實驗組(Ⅰ)，橈足類柱形寬水蚤對牟氏角毛藻的攝食率和濾水率要低于棕囊藻濃度低實驗組(Ⅱ)，尤其是不含棕囊藻的實驗組(Ⅲ)[(120.85±79.07) ng C/(ind.×h) vs(555.63±293.43)ng C/(ind.×h)](圖1a,圖1c，P<0.05)。在海藻酸鈉溶液的攝食實驗中，黏度較大的實驗組(Ⅳ)，柱形寬水蚤對牟氏角毛藻的攝食率和濾水率要顯著低于不含海藻酸鈉的實驗組(Ⅵ)[(11.15±71.95) ng C/(ind.×h) vs (437.71±99.11) ng C/(ind.×h)](圖3b，圖3d,P<0.05)。相對于中等黏度值的實驗組(Ⅴ)，可以看出，柱形寬水蚤的攝食率和濾水率高于黏度較大的實驗組(Ⅳ)，但低于不含海藻酸鈉的實驗組(Ⅵ)。

柱形圖頂端的不同字母表示組間數據存在差異性，P<0.05

3 討論

3.1 棕囊藻的TEP與水體黏度

TEP是指可以被阿利新藍染色的透明顆粒物，主要成分為酸性多糖，具有一定的黏性[21,22]。有研究表明，棕囊藻可以分泌包含有羧基和硫酸鹽基的多糖黏液(Mucus)，然后自發凝結形成TEP[11,20,23]。依據Mari等[19]的研究，棕囊藻可以通過囊體釋放并形成大量TEP，也可以在細胞生長過程中分泌DOC，進一步凝結成TEP。實際上，在自然水體中，這些由棕囊藻分泌出來的DOC及其后續形成的TEP與所在的水體黏度有著一定的關聯性[13,24,25]。

本實驗的結果表明，隨著棕囊藻細胞的生長，水體的TEP含量和黏度值也隨之提高(圖1)。而且，棕囊藻游離單細胞豐度、棕囊藻囊體豐度、囊體直徑與TEP含量、水體黏度有正相關關系(表3)。棕囊藻單細胞繁殖與水體TEP含量呈現正相關關系的結果與Dutz等[13]的研究結果相似，他們在圍隔實驗中發現，水體環境中的TEP含量是隨著棕囊藻的生長而升高的。對于水體黏度與棕囊藻生長的正相關關系(表3)，在德國灣(The German Bight)和北海(The North Sea)沿海水域也有類似的發現，在棕囊藻赤潮發展的前期過程中，葉綠素a與海水的黏度值有著顯著的正相關性[26,27]。

一般來說，浮游植物分泌出DOC，接著溶解的酸性有機物通過鹽橋鏈接而形成TEP[28,29]，雖然黏度與水體中的DOC含量未成一定的線性關系，TEP與DOC也沒有直接的線性關系，但TEP和DOC在水體黏度的改變過程中扮演著重要的角色[16,25]。有研究報道，DOC和TEP的增加給水體中團聚體的形成創造有利條件[30,31]，對于生活史中含有單細胞過渡形成囊體結構這一過程的棕囊藻[4]，先通過分泌DOC，然后再增加水體黏度來促進單細胞過渡到囊體，也是一種較有優勢的生活策略[10,32]。此外，在形成囊體之后繼續分泌DOC也可以起到保護囊體完整性的作用[25]，進一步保證棕囊藻能在惡劣環境中完成生命周期。

3.2 水體黏度對橈足類攝食的影響

實驗結果表明，在不同濃度的棕囊藻細胞培養液中，柱形寬水蚤對食物牟氏角毛藻的攝食率表現出差異性。在硅藻食物量等同的條件下，低黏度實驗組的柱形寬水蚤攝食率高于高黏度實驗組(圖3a)。在黏度影響橈足類攝食的研究報道中，Malej和Harris[15]利用硅藻分泌物的高分子化合物和葡萄糖來調節橈足類(長角寬水蚤、長偽哲水蚤、Pseudocalanuselongatus)攝食實驗的水體環境黏度，發現水體黏度較高的實驗組，橈足類的攝食率低于水體黏度低實驗組；在水體黏度較高的情況下，由于湍流減少，橈足類移動速度下降[16]，與食物的相遇率也會降低，攝食行為比正常情況下耗費更多的能量[33]，橈足類因為捕食行為消耗增高而選擇減少運動攝食行為，降低體能的消耗。本研究結果也支持該觀點，柱形寬水蚤在高黏度的海藻酸鈉實驗組中也表現出相對較低的攝食率(圖3b)。事實上不僅是橈足類，一些原生動物也會被浮游植物分泌的Exopolymer Secretions (EPS)黏液層(Mucus)改變移動方式以及阻礙攝食[34,35]。這意味著，在高濃度的棕囊藻細胞培養液中，橈足類的攝食行為會受到水體黏度的影響。

相反，有研究指出，棕囊藻可以分泌DOC并進一步形成TEP，而橈足類可以通過攝食TEP來補充能量，從而降低對浮游植物的攝食，因此并不是水體的黏度影響了橈足類的攝食率[13,14]。但在本研究的海藻酸鈉攝食實驗中，低黏度實驗組的柱形寬水蚤對牟氏角毛藻的攝食率要高于高黏度實驗組(圖3a、圖3b)，如果水體環境的黏度不足以對橈足類造成攝食障礙，那么各實驗組的柱形寬水蚤的攝食率不會有顯著性的差異。

有研究報道，在發生棕囊藻赤潮海域里，橈足類長角寬水蚤的產卵量和繁殖率與食物充實情況下無異[36]，但在英吉利海峽，棕囊藻赤潮爆發時間卻與該海區浮游動物豐度低值時期重合[37]。欽州灣海域也存在同樣的現象，棕囊藻的囊體豐度高值期與該海域優勢種橈足類強額孔雀水蚤(Paracalanuscrassirostris)豐度的低值期重合[38]， Flamme[36]報道的關于棕囊藻不影響長角寬水蚤產卵量和繁殖量的現象，可以認為是橈足類攝食營養價值更高的原生動物的結果，畢竟相比于浮游植物，原生動物(鞭毛蟲、纖毛蟲)粒級更大，且具有一定的運動能力，在棕囊藻濃度較高、水體黏度較大的情況下，更加容易被橈足類感知和捕食[39]。而且原生動物可以以棕囊藻細胞為食[40]，不太可能因為棕囊藻赤潮的發生而造成豐度下降[41]。

對于棕囊藻赤潮期間觀察到浮游動物豐度降低的現象早有報道，比如棕囊藻分泌有害的毒素，產生二甲基硫化物 (Dimethylsulfide，DMS)[5]，棕囊藻細胞營養價值低[42]以及囊體膠狀結構堵塞捕食者嘴部結構影響攝食[43,44]，都可能是其中的原因。就本研究而言，棕囊藻赤潮與浮游動物豐度下降之間的聯系可以解釋為棕囊藻分泌DOC并凝結形成TEP，進而提高水體黏度[25]，緊接著造成浮游動物機械性的攝食障礙，最后可能使得浮游動物饑餓致死。尤其是一些運動能力較弱又急需通過攝食來補充生長發育所需的無節幼蟲，它們比橈足類成體更加容易受到水體黏度的攝食抑制[13]。

4 結論

本研究以棕囊藻和柱形寬水蚤作為研究對象，探究棕囊藻赤潮帶來的海水黏度變化對橈足類攝食產生的影響。研究結果表明，棕囊藻生長過程中的游離單細胞豐度、囊體豐度、囊體直徑與TEP含量、水體黏度都有顯著的正相關關系；在棕囊藻培養液和海藻酸鈉溶液攝食環境中，水體黏度的提高使得柱形寬水蚤的攝食率下降。整體而論，柱形寬水蚤會受水體黏度的影響而降低對其他浮游植物的攝食，即棕囊藻赤潮造成的海水黏度提高會阻礙橈足類的攝食。