6′-O-月桂酰京尼平苷的酶法合成及其抗炎活性評(píng)價(jià)

楊文猛,倪 芳，姚 忠，陸怡欣，孫 蕓，朱本偉，苑 蘅，熊 強(qiáng)

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800)

京尼平苷(geniposide)是一種天然的環(huán)烯醚萜苷類化合物，廣泛分布于植物的果實(shí)、莖和葉等組織中。如，茜草科的梔子GardeniajasminoidesEllis[1]、水梔子GardeniajasminoidesEllis var.radicans(Thunb.) Makino[2]、大花梔子Gardeniajasminoidesform.grandiflora(Lour.) Makino[3]及朱如拉GardeniajasminodesEllis[4]，杜仲科的杜仲EucommiaulmoidesOliv.，衛(wèi)矛科陜西衛(wèi)矛EuonymusschensianusMaxim.[5]，列當(dāng)科肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma[6]，莧科牛膝AchyranthesbidentataBl.[7]，鱗毛蕨科香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.) Schott[8]和防己科云南青牛膽Tinosporasagittatavar.yunnanensis(S.Y.Hu)Lo[9]等。

京尼平苷是由1分子葡萄糖和1分子京尼平苷元組成(圖1)，其中的京尼平苷元含有活潑的羥基側(cè)鏈和環(huán)氧結(jié)構(gòu)，具有護(hù)肝[10]、抗抑郁[11]、抗氧化[12]、降糖[10]和抗炎[3]等多種生理功能，是傳統(tǒng)中藥的重要成分之一。

圖1 京尼平苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of geniposide

環(huán)烯醚萜苷類化合物家族成員眾多，其中大多數(shù)具有重要的生理活性。這些環(huán)烯醚萜苷類化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基，是?；磻?yīng)的理想底物，對(duì)其進(jìn)行酰基化修飾不僅有利于豐富化合物的結(jié)構(gòu)多樣性，調(diào)整母體化合物的親油/親水平衡(HLB)，并可改善其生物活性、穩(wěn)定性和生物利用度[13-14]。

目前，常用于催化天然產(chǎn)物?；磻?yīng)的酶有水解酶和?；D(zhuǎn)移酶2種。其中，脂肪酶(lipase)催化的酰化反應(yīng)具有底物譜寬、對(duì)映選擇性和區(qū)域選擇性強(qiáng)、耐有機(jī)溶劑以及不需要輔因子等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于催化多種天然產(chǎn)物，如黃酮類和皂苷等多酚類化合物的?；揎梉15-18]。Xanthakis等[19]以月桂酸乙烯酯為酰基供體，脂肪酶Novozyme 435為催化劑對(duì)紫蘇醇苷進(jìn)行了?；揎?，獲得了葡萄糖苷C6位上的酰化產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率高達(dá)84%，克服了紫杉醇的脂溶性差的問(wèn)題并提高了其生物利用率。Singh等[13]以脂肪酶CAL-B作為催化劑，四氫呋喃作為溶劑，比較了不同的酰基供體對(duì)黃連糖苷的?；ЧY(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酰基或丁?；苌锏漠a(chǎn)率較高，其中胡黃連糖苷Ⅱ型糖基上的伯羥基被酰基化形成單?；苌?；而黃連糖苷Ⅰ型中的?；l(fā)生在苷元上的仲羥基上，這可能是由于在黃連糖苷Ⅰ型中，糖基上的伯羥基空間位阻較大。

京尼平苷來(lái)源豐富，且具有重要的生理和藥理功能，但其脂溶性和生物利用度較差。為此本文中，筆者嘗試以月桂酸乙烯酯為酰基供體，對(duì)京尼平苷進(jìn)行?；揎?，考察不同脂肪酶的催化效果，優(yōu)化6′-O-月桂?；┠崞杰?6′-O-LGS)的酶法合成方法；在此基礎(chǔ)上，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化和結(jié)構(gòu)確證，并對(duì)6′-O-LGS的抗炎活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

京尼平苷(98%)，上海士鋒生物科技有限公司；月桂酸乙烯酯(99%)，上海梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；四氫呋喃(THF，分析純)，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；固定化南極假絲酵母脂肪酶A(CaLA)、固定化南極假絲酵母脂肪酶B(CaLB)、固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(TLIM)和固定化米黑根毛霉脂肪酶(RMIM)，丹麥諾維信公司；乙腈(色譜純)，美國(guó)默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LCQ DECA XP PLUS型電噴霧質(zhì)譜儀，美國(guó)賽默飛世爾公司；AVANCE AV-500型核磁共振儀，瑞士布魯克公司。

1.3 6′-O-LGS的制備和結(jié)構(gòu)確證

將京尼平苷與月桂酸乙烯酯以摩爾比1∶ 4溶于預(yù)先經(jīng)4A分子篩脫水的THF中，加入TLIM作為催化劑，于40 ℃搖床中反應(yīng)60 h。濾紙濾去反應(yīng)液中TLIM及其他不溶雜質(zhì)后，用氮吹儀吹干THF，加入乙腈復(fù)溶。以反相高效液相色譜(RP-HPLC)制備色譜(GP-C18，21.2 mm×150 mm)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，并利用質(zhì)譜(MS)、1H NMR、13C NMR、H-H cosy、多鍵碳?xì)潢P(guān)系(HMBC)及異核單量子關(guān)系(HSQC)等方法分析以確定其結(jié)構(gòu)。

1.4 HPLC分析

以HPLC對(duì)6′-O-LGS進(jìn)行定量分析。色譜柱為Sepax Amethyst C18-H柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=80∶ 20；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；進(jìn)樣量為20 μL。在此條件下，6′-O-LGS的保留時(shí)間為5.993 min。6′-O-LGS的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=4.273x+1.337 3，R2=0.999 96。

1.5 6′-O-LGS的酶法合成

1)酶的選擇。在25 mL圓底燒瓶中加入40 mg底物京尼平苷，115 μL?；w月桂酸乙烯酯以及10 mL預(yù)干燥過(guò)的溶劑THF，并分別加入一定量的固定化 CaLA、固定化CaLB(Novozym 435)、TLIM和RMIM，酶活均為1 000 U左右，于40 ℃下攪拌反應(yīng)48 h，轉(zhuǎn)速200 r/min，每組反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行樣。反應(yīng)完畢后以HPLC檢測(cè)反應(yīng)液中6′-O-LGS含量，并計(jì)算反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。

2)酰基受體/供體比與反應(yīng)時(shí)間的確定。在25 mL圓底燒瓶中分別加入40 mg底物京尼平苷、10 mL預(yù)干燥過(guò)的THF以及100 mg TLIM，加入不同量的月桂酸乙烯酯，使受體/供體摩爾比分別為1∶ 1、1∶ 2、1∶ 4、1∶ 6、1∶ 8和1∶ 10。將圓底燒瓶在40 ℃下攪拌反應(yīng)(轉(zhuǎn)速200 r/min)，在反應(yīng)時(shí)間為0.5、1、2、3和5 h時(shí)分別取樣，通過(guò)HPLC檢測(cè)反應(yīng)液中6′-O-LGS含量，并計(jì)算反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。

3)溫度的選擇。在25 mL圓底燒瓶中加入40 mg底物京尼平苷,230 μL酰基供體月桂酸乙烯酯，10 mL預(yù)干燥過(guò)的反應(yīng)溶劑THF以及100 mg TLIM作為催化劑。在不同的溫度條件下(30～50 ℃)攪拌反應(yīng)2 h(轉(zhuǎn)速200 r/min)，反應(yīng)結(jié)束后以HPLC檢測(cè)反應(yīng)液中6′-O-LGS含量，并計(jì)算反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。

1.6 6′-O-LGS的體外抗炎免疫活性的測(cè)定

細(xì)胞株為巨嗜細(xì)胞RAW264.7，使用1 μg/mL脂多糖誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生，誘導(dǎo)時(shí)間為24 h，試驗(yàn)中使用的京尼平苷及6′-O-LGS濃度均為10 μmol/L。

1)溶液的配制。脂多糖(LPS)粉末溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，配制成1.5 mg/mL儲(chǔ)備液待用。京尼平苷和6′-O-LGS均溶于二甲基亞砜(DMSO)中，儲(chǔ)備液濃度均為2 000 μmol/L。

2)細(xì)胞培養(yǎng)。將RAW264.7細(xì)胞分成control組、LPS組、京尼平苷組和6′-O-LGS組。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)滿整個(gè)平皿的70%時(shí)，LPS組用1.0 μg/mL LPS處理，京尼平苷組和6′-O-LGS組分別用10 μmol/L的京尼平苷和6′-O-LGS與LPS聯(lián)合處理。24 h后收樣。

3)炎癥水平檢測(cè)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)炎癥因子IL-6、COX2、IL-1β、p-NF-kB和TNF-α的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 6′-O-月桂?；┠崞杰盏慕Y(jié)構(gòu)確證

按既定方法對(duì)京尼平苷進(jìn)行?；揎?，反應(yīng)結(jié)束后以制備色譜分離反應(yīng)產(chǎn)物，獲得了一種新的化合物(化合物1)，純度達(dá)98.97%(圖2)。

圖2 化合物1的HPLC分析譜圖Fig.2 HPLC analysis for compound 1

化合物1的質(zhì)譜分析結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知：反應(yīng)產(chǎn)物在正離子模式下的質(zhì)荷比(m/z)為593.29，可能為京尼平苷的單月桂酰衍生物的加Na峰(570.3+23)。

圖3 化合物1的正離子質(zhì)譜圖Fig.3 Positive ion mass spectrogram of compound 1

進(jìn)一步對(duì)化合物1和京尼平苷進(jìn)行1H NMR分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知：化合物1低場(chǎng)氫的分布與京尼平苷類似，而高場(chǎng)區(qū)有新的氫出現(xiàn)，且數(shù)量與月桂?；械臍湟恢拢砻骰衔?確為京尼平苷的單月桂酰衍生物。

圖4 京尼平苷和化合物1的1H NMR譜圖Fig.4 1H NMR spectrum of geniposide and compound 1

化合物1的13CNMR、H-H cosy、HMBC及HSQC分析結(jié)果見(jiàn)圖5～8。

圖5 京尼平苷單月桂酰衍生物的13C NMR譜圖Fig.5 13C NMR spectrum of 6′-O-lauroylgeniposide

圖6 6′-O-月桂?；┠崞杰誋-H cosy譜圖Fig.6 H-H cosy spectrum of 6′-O-lauroylgeniposide

圖7 6′-O-月桂酰基京尼平苷HMBC譜圖Fig.7 HMBC spectrum of 6′-O-lauroylgeniposide

圖8 6′-O-月桂酰基京尼平苷HSQC譜圖Fig.8 HSQC spectrum of 6′-O-lauroylgeniposide

通過(guò)對(duì)化合物1核磁一級(jí)譜圖(1H NMR、13C NMR)與二級(jí)譜圖(H-H cosy、HMBC、HSQC)的解析，明確了月桂酰基連接位點(diǎn)為京尼平苷糖基上的6′位伯羥基，因此可確定化合物1的結(jié)構(gòu)為6′-O-月桂?；┠崞杰?6′-O-LGS)，其1HNMR和13C NMR數(shù)據(jù)的全歸屬見(jiàn)圖9。

6′-O-LGS核磁及質(zhì)譜表征數(shù)據(jù)。

1H NMR (500 MHz,DMSO-d6) ：δ5.66 (s,1H),5.24～5.09 (m,3H),4.99 (d,J=7.1 Hz,1H),4.63～4.52 (m,2H),4.26 (dd,J=11.9,2.1 Hz,1H),4.13～3.93 (m,3H),3.64 (s,3H),3.20 (td,J=8.9,4.8 Hz,1H),3.12～2.98 (m,3H),2.75～2.62 (m,2H),2.28～2.21 (m,2H),2.03～1.94 (m,1H),1.48 (t,J=7.2 Hz,2H),1.31～1.21 (m,18H),0.86 (t,J=6.7 Hz,3H)。

13C NMR (126 MHz,Acetone-d6) ：δ125.58、76.36、73.88、73.14、50.97、45.60、40.04、39.96、39.87、 39.79、39.70、39.54、39.37、39.27、39.20、39.03、33.48、 31.27、28.95、28.60、28.41、24.41、22.06、13.91。

ESI-MS，C29H46O11[M+ Na+]+:理論值593.30,實(shí)測(cè)值為593.295 9。

綜合以上分析，在TLIM的催化下，京尼平苷糖基上6′位上的伯羥基被酰基化，得到了京尼平苷衍生物6′-O-LGS，反應(yīng)式如圖10所示。

圖9 6′-O-月桂?；┠崞杰战Y(jié)構(gòu)及核磁譜圖歸屬Fig.9 The structure of 6′-O-lauroylgeniposide

圖10 6′-O-月桂酰基京尼平苷的合成Fig.10 Synthesis of 6′-O-lauroylgeniposide

2.2 6′-O-LGS的合成方法優(yōu)化

2.2.1 酶的選擇

分別以CaLA、Novozym 435、TLIM、RMIM為催化劑，對(duì)京尼平苷進(jìn)行?；揎?，比較4種脂肪酶的催化效果，結(jié)果見(jiàn)圖11。由圖11可知：使用TLIM時(shí)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到85.05%；Novozym 435催化效果低于TLIM，轉(zhuǎn)化率為39.18%；而RMIM和CaLA基本沒(méi)有催化京尼平苷?；?′-O-LGS的活性。

圖11 不同脂肪酶對(duì)酶促酰化反應(yīng)的影響Fig.11 Effects of different lipases on enzymatic acylation reaction

2.2.2 ?；荏w/供體摩爾比對(duì)反應(yīng)的影響

圖12為?；荏w/供體比對(duì)合成效率的影響。由圖12可知：隨著京尼平苷/月桂酸乙烯酯摩爾比的上升，?；磻?yīng)速度和平衡轉(zhuǎn)化率均迅速上升，平衡轉(zhuǎn)化率從摩爾比1∶ 1時(shí)的22.98%上升到摩爾比1∶ 4時(shí)的92.36%。當(dāng)摩爾比高于1∶ 4時(shí)，反應(yīng)初速度仍有提高，反應(yīng)到達(dá)平衡的時(shí)間不斷縮短，而反應(yīng)轉(zhuǎn)化率上升并不顯著(P>0.05)。當(dāng)?shù)孜锬柋雀哂?∶ 8時(shí)，酶促酰化反應(yīng)能在2 h內(nèi)迅速達(dá)到反應(yīng)平衡狀態(tài)(93.26%)。綜合考慮試劑及時(shí)間成本的節(jié)約與后續(xù)分離純化的要求，選擇京尼平苷/月桂酸乙烯酯摩爾比為1∶ 8為最優(yōu)投料比。

圖12 不同投料比條件下轉(zhuǎn)化率-時(shí)間曲線Fig.12 The conversion rate-time curve under different feed ratios

2.2.3 溫度對(duì)反應(yīng)的影響

在30～50 ℃范圍內(nèi)，考察不同溫度條件下酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見(jiàn)圖13。由圖13可知:在30 ℃時(shí)反應(yīng)初始速率略低于35～50 ℃時(shí)的反應(yīng)初始速率，但是差別并不顯著(P>0.05)；溫度區(qū)間內(nèi)反應(yīng)的2 h轉(zhuǎn)化率基本一致，溫度對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率影響不大。綜合考慮實(shí)驗(yàn)條件、反應(yīng)速率、達(dá)到反應(yīng)平衡時(shí)間及能源節(jié)約等因素，選擇40 ℃作為反應(yīng)溫度。

圖13 不同反應(yīng)溫度對(duì)酶?；磻?yīng)的影響Fig.13 Effects of different reaction temperature on enzymatic acylation reaction

2.3 6′-O-LGS抗炎活性評(píng)價(jià)

分別對(duì)京尼平苷和6′-O-LGS的體外抗炎活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本研究采用的方法是用脂多糖(LPS)處理巨嗜細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，刺激炎癥的發(fā)生，建立炎癥模型，然后加入京尼平苷及6′-O-LGS對(duì)炎癥進(jìn)行抑制，通過(guò)Western blotting 方法測(cè)定LPS組、Control組、京尼平苷組及6′-O-LGS組炎癥因子(IL-6、COX2、IL-1β、p-NF-kB、TNF-α)的表達(dá)，從而驗(yàn)證京尼平苷及其衍生物的體外抗炎免疫活性并進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)內(nèi)參為β-actin。

圖14為梔子苷和6′-O-月桂酰梔子苷的抗炎免疫活性。由圖14可知，炎性因子在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)的不同。脂多糖處理模型組(LPS組)和未經(jīng)處理的空白對(duì)照組(Control組)相比，各個(gè)炎性因子的蛋白表達(dá)均增強(qiáng)。與模型組(LPS組)對(duì)比，京尼平苷組和6′-O-LGS組各個(gè)炎性因子的表達(dá)均減弱，其中6′-O-LGS組的抑制效果比京尼平苷組更為明顯，其中對(duì)炎性因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)的抑制作用差距最為明顯，而對(duì)白介素-6(IL-6)的抑制效果則相差不大?？傮w來(lái)說(shuō)，京尼平苷與6′-O-LGS均可以顯著抑制炎癥因子的表達(dá)，且相同濃度下6′-O-LGS的抑制效果更明顯。

圖14 梔子苷和6′-O-月桂酰梔子苷的抗炎免疫活性比較Fig.14 Comparation of anti-inflammatory immune activity of geniposide and 6′-O-lauroylgeniposide

京尼平苷的?；揎楇m然顯著提高了物質(zhì)的脂溶性，但是并未對(duì)苷元部分結(jié)構(gòu)造成很大的影響，因此認(rèn)為抗炎活性的差異可能源自于京尼平苷與6′-O-LGS脂溶性的差異。京尼平苷水溶性極強(qiáng)，這限制了其透過(guò)生物膜的能力，而進(jìn)行過(guò)酰基化修飾的6′-O-LGS是脂溶性的，更容易被細(xì)胞膜選擇性透過(guò)，其生物利用率也會(huì)更高，從而加強(qiáng)了其抗炎效果。

3 結(jié)論

以脂肪酶TLIM為催化劑，以月桂酸乙烯酯為?；w，對(duì)京尼平苷進(jìn)行了?；揎?，確證了?；a(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，并優(yōu)化了酶促反應(yīng)條件；在此基礎(chǔ)上，對(duì)?；a(chǎn)物6′-O-LGS的抗炎活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，得到如下結(jié)論：

1)通過(guò)制備色譜純化，獲得了一種新的京尼平苷酰化產(chǎn)物，純度達(dá)98.97%。

2)經(jīng)質(zhì)譜(MS)、1H NMR、13C NMR、H-H cosy、HMBC及HSQC分析，確證其結(jié)構(gòu)為6′-O-月桂?；┠崞杰?6′-O-LGS)。

3)在CaLA、Novozym 435、TLIM和RMIM這4種脂肪酶中，TLIM的催化效率最高，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到85.05%，而RMIM和固定化的 CaLA則幾乎沒(méi)有催化活性。

4)TLIM催化合成6′-O-LGS的最優(yōu)條件：溶劑四氫呋喃，京尼平苷/月桂酸乙烯酯投料摩爾比1∶ 8，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時(shí)間2 h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)93.26%。

5)在脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中驗(yàn)證了6′-O-LGS的抗炎活性，結(jié)果顯示6′-O-LGS對(duì)5種炎癥因子(IL-6、COX2、IL-1β、p-NF-kB、TNF-α)均具有抑制作用，其中對(duì)TNF-α的抑制作用最為明顯，活性優(yōu)于相同濃度的京尼平苷。