滴定法快速測定發酵液中植酸酶活性

公維麗，韓慶曄，馬耀宏，王丙蓮，楊 艷，孟慶軍，楊俊慧，劉慶艾，蔡 雷，史建國

(1.齊魯工業大學(山東省科學院) 山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250103；2.山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250103)

植酸酶(EC 3.1.3.8,EC 3.1.3.26,EC 3.1.3.72)是一類磷酸酶，它可以特異性降解植酸中的磷酸基團。目前植酸酶已應用于多個領域，如動物飼料、環境和醫藥領域[1-2]。隨著植酸酶需求的日益增加，準確測定植酸酶的活性對植酸酶生產過程優化控制具有重要意義，這也是保證植酸酶酶制劑質量和功能的關鍵[3-5]。

發酵液中植酸酶活性測定的傳統方法為比色法，通過植酸酶降解植酸產生的無機磷與鉬酸銨反應，生成黃色復合物，在波長415 nm下進行比色測定[6-7]。然而在微生物發酵培養基中，通常添加大量的KH2PO4和K2HPO4以提供微生物生長所需的磷元素，使得植酸酶發酵樣品中含有高含量的背景無機磷[8]。因此，在植酸酶活性測定中，高含量的背景無機磷(約1.48 ～1.98 mg/mL )會掩蓋短時間內植酸酶作用于植酸產生的無機磷，導致植酸酶活性測定波動較大、可重現性低[3]。為排除植酸酶發酵樣品中背景無機磷的干擾，以前的研究多采用透析的方法去除背景無機磷，但是筆者的研究結果顯示，植酸酶發酵樣品至少需要透析6 h才可以將背景無機磷去除徹底[9]，而長時間的透析無法滿足大規模植酸酶發酵行業中植酸酶活性的準確、快速測定。

近些年來，隨著新型技術的發展和檢測手段的提高，除傳統的比色法外，許多新的方法也應用到植酸酶活性分析檢測方面，如瓊脂平板法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附法等[10-12]。Bae等[10]建立的瓊脂平板法主要通過在培養混合菌的瓊脂平板(添加植酸鈉)上加入氯化鈷、鉬酸銨-釩酸銨等染色劑，在產植酸酶的微生物周圍可出現明顯的染色條帶，此方法在產植酸酶菌的簡便、快速篩選中具有明顯優勢，但其缺點是無法對植酸酶活性進行定量測定。高效液相色譜法是以人工合成底物植酸的類似物(TInsP5)為探針建立的，該方法可以對植酸酶活性進行快速、準確、高靈敏的檢測，但是測定所需的設備昂貴，操作繁瑣、要求高，因此不適合普通實驗室和工業規模發酵樣品的測定[11]。酶聯免疫吸附法具有高特異性、高靈敏性的特點，但要求樣品純度高、抗原性強，且需酶標記抗原或抗體等繁瑣操作才可實現檢測，大大增加檢測的成本[12]。

因此，為了進一步開發可應用于工業規模植酸酶活性測定的方法，本研究基于單位酶活可用單位時間、單位體積中底物的減少量來表征的原理，擬建立一種簡單的滴定方法和裝置，以實現植酸酶活性的準確、快速測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TECAN酶標儀，瑞士TECAN公司；植酸酶活性測定儀,筆者課題組自主研發。

鉬酸銨((NH4)2MoO4)、釩酸銨(NH4VO3)、硝酸(HNO3)、醋酸、醋酸鈉、三氯化鐵(FeCl3)、磺基水楊酸、三氯乙酸，生工生物工程(上海)有限公司；植酸鈉，美國Sigma公司；標準植酸酶(44 000 U/g)，濰坊康地恩生物科技有限公司；植酸酶發酵樣品由畢赤酵母GS115植酸酶工程菌產生。

1.2 實驗條件

1.2.1 國標法測定植酸酶發酵樣品的酶活性

國標法測定植酸酶發酵樣品中酶活性的操作步驟和反應體系：實驗組先加入90 mL醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)，10 mL待檢測植酸酶發酵樣品，充分混勻，于37 ℃預熱5 min，加入200 mL植酸鈉底物(7.5 mmol/L)，充分混勻后于37 ℃反應30 min，加入200 mL終止顯色液((NH4)2MoO4、NH4VO3和HNO3的體積比為1∶ 1∶ 2)終止反應，在波長415 nm下進行比色測定；對照組先加入90 mL醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)，10 mL待檢測植酸酶發酵樣品，200 mL終止顯色液，充分混勻，于37 ℃預熱5 min，200 mL植酸鈉底物(7.5 mmol/L)，充分混勻后于37 ℃反應30 min，在波長415 nm下進行比色測定。

植酸酶國際酶活單位定義：植酸酶在1 min內作用于植酸鈉底物(5 mmol/L)釋放1 μmol/L無機磷等同于一個酶活單位的植酸酶活性。

1.2.2 自主研發植酸酶活性測定儀

植酸能與Fe3+在酸性條件下生成穩定的化合物，用標定的FeCl3滴定植酸，用磺基水楊酸做指示劑，當Fe3+稍過量時即與磺基水楊酸生成紫紅色的化合物，從而顯示終點，根據這一原理[13]，筆者自主研發了一種利用滴定方式進行植酸酶發酵液中植酸酶活性的測定裝置，其構造如圖1所示。在工作過程中，計算機控制系統調控⑧吸取5 mL工作液(磺基水楊酸-乙酸緩沖液(由2 mL質量分數為10%的磺基水楊酸鈉與100 mL乙酸緩沖液配制))加入滴定池，吸取5 mL待測樣品液從①加入滴定池，開啟⑥，采用0.03 mol/L FeCl3溶液對所述待測樣品液進行滴定，至工作液指示反應終點時結束滴定。

①—進樣口;②—滴定池;③—光電檢測裝置;④—液體泵;⑤—清洗液瓶;⑥—滴定泵;⑦—滴定液瓶;⑧—液體泵;⑨—工作液瓶;⑩—攪拌子;—液體泵;—廢液瓶圖1 植酸酶發酵液中植酸酶活性的測定裝置Fig.1 Schematic diagram of detection device for determination of phytase activity in fermentation broth

1.2.3 植酸鈉濃度-滴定時間線性標準曲線制備

配制3、6、9、12、15和18 mmol/L的植酸鈉溶液，分別吸取5 mL不同濃度的植酸鈉溶液加入滴定池，采用0.03 mol/L FeCl3溶液對所述待測樣品液進行滴定，至工作液指示反應終點時結束滴定，記錄滴定時間，每個植酸鈉濃度測定4次，以T1、T2、T3和T4表示。

1.2.4 待測樣品液制備及酶活計算

分別稱取1.36、2.8、4.1、5.5和6.8 g標準植酸酶(44 000 U/g)，溶于10 mL超純水中，配制系列酶活單位(200、400、600、800和1 000 U/mL)的植酸酶溶液。分別取4 mL不同酶活單位的植酸酶溶液與36 mL乙酸緩沖液(pH 5.5)和80 mL植酸鈉溶液(18 mmol/L)混合，反應30 min，向所得體系中加入三氯乙酸-乙酸緩沖液終止酶解反應，得到標準植酸酶待測樣品液。同時，分別取4 mL不同發酵時期的植酸酶發酵稀釋液與36 mL乙酸緩沖液(pH 5.5)和80 mL植酸鈉溶液(18 mmol/L)混合，反應30 min，向所得體系中加入三氯乙酸-乙酸緩沖液終止酶解反應，得到發酵樣品待測液。

根據預定的植酸鈉消耗的物質的量與滴定時間的線性標準曲線，得到植酸鈉消耗的物質的量為Sx。發酵液中植酸酶活性E計算見式(1)。

E=(S0-Sx)d/t

(1)

式中：S0為酶解反應前體系中植酸鈉的物質的量，Sx為滴定完成后植酸鈉消耗的物質的量，t為酶解反應的時間，d為植酸酶發酵液的稀釋倍數。

2 結果

2.1 植酸鈉濃度與滴定時間關系探究

在利用FeCl3(0.03 mol/L)滴定不同濃度植酸鈉底物(3、6、9、12、15和18 mmol/L)過程中，通過光電檢測裝置記錄光電信號強度隨滴定時間變化,結果見圖2。由圖2(a)～(f)可知：FeCl3與反應池中的植酸鈉反應生成白色絡合物過程中光電信號強度保持不變，當植酸鈉消耗完，稍過量的Fe3+與磺基水楊酸生成紫紅色絡合物，此時光電信號強度出現明顯的拐點，以此顯示終點。將植酸鈉濃度與突變拐點對應的時間值(17.397 5±0.012 58、28.007 5±0.017 08、38.04±0.036 51、48.992 5±0.022 17、58.007 5±0.030 96和69.015±0.031 09 s)做相關性分析，結果見圖2(g)，相關數據分析見表1。由圖2(g)和表1可知：兩者的相關性系數R2=0.999 41，說明植酸鈉濃度在3～18 mmol/L范圍內滴定突變拐點對應的時間值可以準確反映植酸鈉底物濃度，并且為保證后續酶活測定實驗中底物過量，所以確定以18 mmol/L植酸鈉用于以下酶活測定實驗。

圖2 FeCl3滴定不同濃度植酸鈉底物過程中光電信號強度隨滴定時間變化Fig.2 Changes of photoelectric signal intensity with titration time before and after reaction in the process of FeCl3 titration of sodium phytate with different concentrations

表1 FeCl3滴定不同濃度植酸鈉底物過程中光電信號強度突變拐點對應的時間值

2.2 植酸酶酶活與滴定時間關系探究

進一步利用FeCl3滴定不同酶活單位植酸酶標準酶(200、400、600、800和1 000 U/mL)與相同濃度植酸鈉底物(18 mmol/L)反應前后光電信號強度隨滴定時間的變化結果見圖3。由圖3可知：FeCl3滴定不同酶活單位的植酸酶標準酶與植酸鈉底物反應30 min后的溶液，其光電信號突變拐點時間(33.665±0.456 76、24.72±0.665、22.45±1.095 72、17.987±0.793 7和11.485±0.214 4 s)明顯少于FeCl3滴定相對應的滅活不同酶活單位的植酸酶標準酶與植酸鈉底物反應30 min后溶液出現的突變拐點時間值(43.305±0.503 09、42.36±0.273 62、43.787 5±0.752 57、43.997 5±0.556 62和42.075±1.087 89 s)(表2)，并且隨著酶活增加，兩者相應突變拐點差值也逐漸增大(9.64、18.188、21.34、26.010和30.59 s)。將FeCl3滴定不同酶活單位標準植酸酶酶解底物前后突變拐點時間差值與酶活單位做相關性分析，兩者的相關性系數R2=0.972 8(圖3(f))，說明植酸酶酶活在200～1 000 U/mL范圍內，滴定突變拐點時間差值可以準確反映植酸酶酶活大小。

圖3 FeCl3滴定不同酶活單位植酸酶標準酶與相同濃度植酸鈉底物(18 mmol/L)反應前后光電信號強度隨滴定時間的變化Fig.3 Changes of photoelectric signal intensity with titration time before and after the reaction of phytase standard enzyme with the same concentration of sodium phytate(18 mmol/L) by FeCl3 titration

表2 FeCl3滴定不同酶活單位植酸酶標準酶與相同濃度植酸鈉底物(18 mmol/L)反應前后光電信號強度突變拐點對應的時間值

2.3 國標法和滴定法分別測定發酵液中植酸酶酶活性相關性分析

基于植酸鈉濃度與突變拐點時間值標準曲線以及植酸酶酶活大小與突變拐點時間差值標準曲線，筆者利用滴定法測定發酵前期、中期和后期的植酸酶酶活(圖4(a0)～4(c1))，結果表明:具有酶活性的植酸酶發酵液與植酸鈉的反應液滴定時間(31.78±0.15、29.22±0.30和24.15±0.25 s)明顯少于相應的滅活植酸酶發酵液與植酸鈉的反應液滴定時間(45.28±0.089、45.52±0.33和44.14±0.23 s)(表3)，并且隨著植酸酶發酵液發酵時間的延長，兩者的滴定時間差值越大(13.5、16.3和19.99 s)，由此說明隨著發酵時間延長，植酸酶逐漸積累。

同時，我們也利用國標法對發酵前期、中期和后期的植酸酶酶活性進行了測定，將滴定法計算所得的植酸酶酶活與國標法測得的酶活做準確性對比(圖4(d)),結果顯示:兩者呈線性相關，并且相關性系數R2=0.997 3，說明滴定法測得的酶活大小與國標法測定結果相一致。而且利用凝膠電泳對發酵前期、中期和后期的植酸酶發酵液檢測結果(圖4(e))也同樣驗證了植酸酶隨著發酵時間的延長逐漸積累。

圖4 FeCl3滴定不同發酵時期產生的植酸酶與相同濃度植酸鈉底物(18 mmol/L)反應前后光電信號強度隨滴定時間的變化Fig.4 Changes of photoelectric signal intensity with titration time before and after the reaction of phytase produced in different fermentation periods with the same concentration of sodium phytate substrate(18 mmol/L) by FeCl3 titration

3 討論

植酸酶是一類酶的總稱，其酶活一直很難進行準確測定[14]，本研究中，筆者建立的滴定法是對植酸酶活性測定方法的進一步開發和應用。此方法與其他方法相比，對設備要求不高、操作簡單，實驗所用的滴定液(FeCl3和磺基水楊酸)配制簡單、成本低，而且植酸酶發酵樣品無需經過透析除背景無機磷操作，酶活測定更加省時、省力(表4)。

趙凱等[15]通過對工業規模產植酸酶的畢赤酵母發酵條件優化，可以使植酸酶酶活在發酵初期(甲醇誘導12 h)達到963 U/mL，發酵末期最高可達21 666 U/mL，本研究建立的滴定法在200～1 000 U/mL酶活范圍內可以實現植酸酶活性的準確測定，因此發酵液最高僅需稀釋二十幾倍即可達到準確測定范圍，避免引入過大的測量誤差，在大規模植酸酶工業發酵樣品的簡便、快速測定中具有重要的應用價值。

4 結論

基于滴定法原理，通過光電信號變化計算植酸酶底物變化量，進而推算出植酸酶酶活大小，滴定法與國標法測得的植酸酶酶活具有很好的相關性，且滴定法可以避免發酵液中磷的干擾，無需長時間的樣品透析預處理，減少發酵液樣品顏色及渾濁造成的終點判斷誤差，可以更加準確地測定植酸酶酶活。由此可見，筆者研制的植酸酶酶活測定儀在大規模植酸酶生產企業中將為植酸酶酶活測定節省大量人力、物力和財力。

表3 FeCl3滴定不同發酵時期產生的植酸酶與相同濃度植酸鈉底物(18 mmol/L)反應前后光電信號強度突變拐點對應的時間值

表4 滴定法與其他植酸酶測定方法的比較