橋聯黃素再生NAD+耦聯L-谷氨酸脫氫酶高效產α-酮戊二酸

譚卓濤，付靜雯，張肖旺，韓耀穎，付亞萍，朱晨杰，應漢杰

(南京工業大學 生物與制藥工程學院 國家生化工程技術研究中心，江蘇 南京 211800)

α-酮戊二酸(α-KG)是一種重要的二羧酸：在三羧酸循環中參與氨基酸的形成，在氨基酸代謝中參與氮的運輸；同時，α-KG在有機合成如雜環構建，藥物領域如保健品、傷口愈合成分中都有廣泛的應用[1]。常見的α-KG的生產方法包括化學合成法、微生物發酵法和生物轉化法。化學合成α-KG需要經過多步反應，且合成過程使用的氰化物與伴隨產生的有毒副產物極度污染環境[2]。微生物發酵以正鏈烷烴，或者乙醇、甘油等為底物，由于各種副產物的分離提高了生產成本，仍處于實驗室研究階段[3-4]。生物轉化法尤其是酶催化具有以下特點：第一，酶催化化學選擇性、區域選擇性、立體選擇性高，有利于提高生產效益；第二、酶催化反應條件溫和，常在常溫常壓和水中進行，更加安全且無污染。綜上所述，酶法生產α-KG具有很好的前景。

工業上L-谷氨酸產能過剩(2018年，我國L-谷氨酸的產量大約250萬t)，因此以廉價的L-谷氨酸為原料生產α-KG是極有優勢的。L-谷氨酸氧化酶(LGOX)、L-氨基酸氧化酶(LAAO)、L-谷氨酸脫氫酶(L-GluDH)被報道可用于酶法轉化L-谷氨酸生產α-KG。其中，來自奇異變形菌(Proteusmirabilis)的LAAO對L-谷氨酸的底物特異性差且酶活受到產物α-KG的嚴重抑制[5]，來自鏈霉菌(Streptomycesspecies)的LGOX酶活較低，需要優化異源表達所用的載體和宿主以期提高其表達量及酶活[6]。L-GluDH可以催化L-谷氨酸和α-KG間的可逆反應，因此在L-GluDH催化L-谷氨酸氧化脫氨過程中需要構建氧化型煙酰胺輔因子NAD+再生過程[7-8]以降低成本的同時推動反應朝生成α-KG的方向進行，最常用的方法是耦聯NADH氧化酶[9]，但雙酶耦聯時對酶促反應速率的匹配要求限制了其大規模應用。最近研究發現金屬有機配合物如銠配合物[10]、鐵卟啉[11]等可以作為NADH氧化酶類似物再生NAD(P)+，但由于金屬有機配合物具有成本高、易導致酶失活、后處理比較困難等缺點，不適用于大規模工業化生產。課題組前期的工作發現，人工黃素類似物——橋聯黃素7-三氟甲基-N1,N10-乙烯基異咯嗪氯化物(F4)能高效再生NAD(P)+，且結構簡單、水溶性好、不影響酶活[12]。因此，筆者擬采用F4再生NAD+耦聯L-谷氨酸脫氫酶催化L-谷氨酸至α-KG，技術路線見圖1。通過單因素考察結合響應面法，以α-KG收率為目標，優化酶促反應條件。

圖1 橋聯黃素再生煙酰胺輔因子(NAD+)耦聯 L-谷氨酸脫氫酶產α-KGFig.1 The coupled system of enzymatic converting sodium L-glutamate monohydrate(MSG) to α-KG employing F4 for NAD+ regeneration

1 材料與方法

1.1 原料

L-谷氨酸鈉和β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)(分析純)，Aladdin公司；α-酮戊二酸鈉鹽(分析純)，Sigma公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、K2HPO4、KH2PO4、Na2CO3、NaHCO3和NaCl(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷(分析純)、胰蛋白胨、酵母提取物和卡那霉素，生工生物工程(上海)有限公司；鹽酸(分析純)，西隴化工股份有限公司。

1.2 酶的來源

過氧化氫酶及來自變形桿菌(Proteusspecies)的L-谷氨酸脫氫酶，Sigma公司；來自艱難梭菌(Clostrdiumdifficile)CICC 22951的L-谷氨酸脫氫酶由實驗室篩選得到。

1.3 橋聯黃素7-三氟甲基-N1,N10-乙烯基異咯嗪氯化物(F4)的合成

參照文獻[12]的方法制備橋聯黃素。

1.4 來源于艱難梭菌(Clostrdium difficile)的L-谷氨酸脫氫酶的制備

參照文獻[13]的方法制備來源于艱難梭菌的L-谷氨酸脫氫酶：構建大腸桿菌重組菌BL21(DE3)-pET28a-GluDH，在含0.1%卡那霉素的LB液體培養基中進行培養(37 ℃，200 r/min，12 h)至OD600為0.6～0.8，加入IPTG(終濃度為0.6 mmol/L)進行誘導產酶(25 ℃，200 r/min，24 h)，經破碎、離心、過濾、Ni-NTA純化柱純化、超濾過程后得到純酶液，測定酶活后使用。

1.5 橋聯黃素再生煙酰胺類輔因子與L-谷氨酸脫氫酶耦聯體系

以10 mL反應體系為例：15 mmol/L L-谷氨酸鈉、1 mmol/L NAD+、1 mmol/L F4，pH 9三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液，過氧化氫酶50 U/mL，加入L-谷氨酸脫氫酶5 U/mL啟動反應，反應液與外界空氣相通。分別取反應4、8、12和24 h的反應液 200 μL，加入800 μL水稀釋，過0.22 μm水系濾膜后利用液相檢測反應進程。

1.6 分析方法

1)谷氨酸脫氫酶酶活測定。1 mL反應體系如下：3 mmol/L L-谷氨酸鈉、0.2 mmol/L NAD+、100 mmol/L、Tris-HCl緩沖溶液(pH 8)，加入適量L-谷氨酸脫氫酶酶液啟動反應，利用紫外-可見分光光度計測定波長340 nm處NADH吸光度的變化ΔA。酶活定義：在L-谷氨酸氧化反應中每分鐘內催化生成1 μmol NADH所需的酶量為一個單位，酶活計算見式(1)。

(1)

式中：ΔA表示1 min內吸光值的變化；V表示反應體系總體積,mL；6 220 為摩爾消光系數，L/(mol·cm)；l表示光程為1 cm。

2)α-酮戊二酸的檢測。采用HPLC法定量分析反應產物α-KG，色譜條件如下：有機酸柱Aminex HPX-87H (300 mm×7.8 mm)，流動相為5 mmol/L H2SO4，進樣量10 μL，流速0.6 mL/min，柱溫35 ℃，紫外檢測器的波長為205 nm，α-KG的保留時間為8.674 min。

3)α-酮戊二酸收率計算。利用外標法定量分析液相檢測結果，配制一系列質量濃度為0.2～2.7 g/L的α- KG標準溶液，檢測不同質量濃度下α-KG對應的峰面積，得到峰面積對α-KG濃度的標準曲線。利用此標準曲線計算不同反應時間的峰面積所對應的α-KG濃度，α-KG收率的計算見式(2)。

α-KG收率=HPLC外標法測得的產物濃度/L-谷氨酸的起始濃度 ×100%

(2)

2 結果與討論

2.1 單因素考察

由于酶對特定底物的活性與酶的來源相關，同一種酶的酶活受緩沖液類型的影響，且L-GluDH的活性還受到產物α-KG、NADH的抑制[14]，而F4的用量會間接影響體系內NADH的濃度，體系pH對酶的活性及產物α-KG的穩定性也有顯著的影響，因此需要考察L-GluDH的來源、緩沖溶液類型、NADH及F4用量、體系pH對α-KG收率的影響。

2.1.1 來源不同的L-谷氨酸脫氫酶對反應的影響

來自艱難梭菌的L-GluDH受到的抑制作用較小[11]，因此對比了來自艱難梭菌(Clostrdiumdifficile)的L-GluDH以及商品化的來自變形桿菌(Proteusspecies)的L-GluDH與F4耦聯時的α-KG收率，結果見圖2。由圖2可知：來自艱難梭菌的L-GluDH顯示出高的催化活性，因此選用來自艱難梭菌的L-GluDH作為酶源，F4耦聯來自艱難梭菌的L-GluDH反應24 h α-KG收率達92%左右(產量2.02 g/L)，高于NADH氧化酶、三價鐵卟啉作為再生催化劑時的結果，初步證實F4作為NAD+再生催化劑耦聯L-GluDH具有很大優勢。

圖2 L-谷氨酸脫氫酶的來源對α-KG收率的影響Fig.2 Effects of the source of L-glutamate dehydrogenase on yield of α-ketoglutarate

2.1.2 不同類型緩沖液、NAD+的濃度、橋聯黃素濃度、pH對反應的影響

考察不同類型緩沖液、NAD+的濃度、橋聯黃素濃度、pH對α-KG收率的影響，結果見圖3。由圖3可知：在pH緩沖范圍不同的檸檬酸緩沖(CPBS)、K2HPO4/KH2PO4緩沖(KPi)、羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖(Tris-HCl)、碳酸鹽緩沖(CBS)條件下，L-GluDH催化L-谷氨酸的能力不同，Tris-HCl與L-GluDH的相容性最好，因此選擇Tris-HCl 作為緩沖液。

當NAD+的濃度為1 mmol/L時，α-KG收率達到最大值。隨著NAD+濃度的增加，α-KG收率反而在明顯下降，這是因為生成的NADH沒有立刻被F4再生成NAD+，導致NADH濃度過高，從而抑制了L-GluDH的活性，因此選擇NAD+的濃度為1 mmol/L繼續探究F4的用量。

當F4的濃度為1 mmol/L時，α-KG收率相對較高，當繼續增加F4用量，α-KG收率顯著下降，說明F4具有通過氧化NADH到NAD+來降低NADH對L-GluDH抑制的作用，但過高的F4可能也會對L-GluDH產生抑制作用。因此需要繼續探究NAD+和F4的使用比例，找到α-KG收率變化的拐點所對應的NAD+濃度和F4濃度。

當pH為8或9時，α-KG收率都較高，pH為9時，中間反應過程明顯比pH 8時的快，但隨著時間的延長，由于α-KG在堿性強的條件下容易分解，α-KG收率增高幅度逐漸變慢。

圖3 不同因素對α-KG收率的影響Fig.3 Effects of different factor on yield of α-KG

2.2 響應面設計

為了能更好地滿足工業化生產α-KG的要求，使用響應面分析法對工藝條件進行優化，利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken design[15]模塊，結合單因素實驗的結果，設計三因素三水平實驗，考察NAD+的濃度(A)、F4的濃度(B)和pH(C)對α-KG收率的影響，根據實驗方案進行15組平行實驗(表1)，以α-KG收率為響應值進行回歸模擬得到二次回歸方程：

產率=95.57+2.20A+9.01B+4.66C-3.65AB-4.10AC-2.32BC-13.15A2-13.32B2-11.22C2。

方差分析(ANOVA)和F檢驗的結果見表2。由表2可知：模型P<0.05，達到顯著水平，而失擬項P=0.066 7>0.05，模型失擬不顯著，說明該方程擬合度高，可用于α-KG收率的分析預測。從P值大小可以看出：一次項B、C，交互項AB、AC，二次項A2、B2、C2對α-KG收率影響顯著，說明各因素對α-KG收率影響不是簡單的線性關系，且其中F4濃度(B)對α-KG收率有很大的影響(P=0.000 2<0.05)。

考察因素間交互作用對α-KG收率的影響，結果見圖4～6。由圖4可知：NAD+和F4濃度對α-KG收率影響顯著，且在一定范圍內α-KG收率隨著NAD+和F4的濃度增高而增高，過高的NAD+和F4濃度都不利于α-KG的生產，與單因素試驗的結果相符合；pH過小或者過大都對α-KG收率都是不利的，在略偏堿性的條件下有利于α-KG的生產和穩定。同時由等高線圖可知，回歸模型存在穩定點，即為α-KG最高收率，利用回歸方程預測最高α-KG收率為97.4%(產量2.14 g/L)，對應的工藝參數條件：NAD+濃度1 mmol/L，F4濃度1.16 mmol/L，pH 8.17，修正取整后(NAD+濃度1 mmol/L，F4濃度1 mmol/L，pH 8)進行實驗驗證發現，24 h后α-KG的收率達到96.4%(產量2.11 g/L)，與模型預測基本一致。相比文獻[9]報道的NADH氧化酶酶法再生NAD+與L-谷氨酸脫氫酶耦聯生產α-KG，收率提高了15%左右。在最優條件下，在1 L的氣升式發酵罐中放大反應，利用來自艱難梭菌的L-谷氨酸脫氫酶在Tris-HCl緩沖液環境下催化15 mmol/L的L-谷氨酸進行氧化脫氨反應，24 h后α-KG的收率為92%(產量2.02 g/L)，說明該模型能夠較為正確地預測出各因素對α-KG收率的影響，以用于指導α-KG的工業化生產。

表1 響應面實驗設計及結果

表2 回歸方程的方差分析

圖4 NAD+濃度和F4濃度對α-KG收率的影響Fig.4 Effects of NAD+ and F4 concentration on yield of α-KG

圖5 NAD+濃度和pH對α-KG收率的影響Fig.5 Effects of NAD+ concentration and pH value on yield of α-KG

圖6 F4濃度和pH對α-KG收率的影響Fig.6 Effects of F4 concentration and pH value on yield of α-KG

3 結論

橋聯黃素7-三氟甲基-N1,N10-乙烯基異咯嗪氯化物(F4)能高效再生NAD(P)+，且結構簡單、水溶性好、不影響酶活，利用F4耦聯L-谷氨酸脫氫酶，構建新型α-KG生產體系。通過單因素考察響應面法優化反應條件，得出最佳參數：NAD+濃度1 mmol/L、F4濃度1 mmol/L、pH 8，在底物L-谷氨酸濃度為15 mmol/L條件下放大反應24 h后，α-KG的收率為92%(產量2.02 g/L)，同時NAD+的用量從2 mmol/L降低至1 mmol/L，降低了生產成本，該耦聯體系為得到高產量的α-KG提供了一種新途徑。同時再次證明，F4有望與更多依賴NAD+的氧化還原酶反應體系兼容，如與甘油脫氫酶耦聯催化甘油至高附加值的1，3-二羥丙酮，具有廣闊的應用前景。